In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

Summary

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

Abstract

Esta contribuição de vídeo e artigo apresenta uma descrição abrangente de microinjeção e eletroporação de testículo do rato in vivo. Esta técnica de transfecção particular para células testiculares de mouse permite o estudo de processos exclusivos na espermatogênese.

O protocolo a seguir concentra-se em transfecção de células de testículo de rato, com as construções de plasmídeos. Especificamente, utilizou-se o vector repórter pEGFP-C1, que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) e também o vector pDsRed2 N1-expressar a proteína fluorescente vermelha (DsRed2). Ambos os genes repórter foram codificados sob o controlo do promotor de citomegalovírus humano imediato precoce (CMV).

Para realizar a transferência de genes em testículos de rato, as construções de plasmídeos repórter são injectados em testículos de ratos vivos. Para esse efeito, o testículo de um animal anestesiado é exposta e o local de microinjecção é preparado. O nosso lugar preferido deinjeção é o ducto eferente, com a rede testicular, em última instância conectada como a rota de transporte anatômica dos espermatozóides entre o testículo e epidídimo. Desta forma, o enchimento dos túbulos seminíferos após microinjecção é excelentemente gerido e controlado, devido à utilização de soluções de ADN coradas. Depois de observar um enchimento suficiente do testículo por sua estrutura tubular de cor, o órgão é electroporado. Isto permite a transferência da solução de ADN para dentro das células dos testículos. Na sequência de 3 dias de incubação, os testículos são removidos e investigada sob o microscópio de fluorescência verde ou vermelho, ilustrando o sucesso da transfecção.

Geralmente, este protocolo pode ser utilizado para a entrega de DNA- ou RNA- constrói na vida do mouse testis, a fim de (mais) expressar ou derrubar genes, facilitando na análise da função dos genes vivo. Além disso, é adequado para o estudo de construções repórter ou regula gene putativoelementos Conservador. Assim, as principais vantagens da técnica de eletroporação é rápido desempenho em combinação com baixo esforço, bem como o equipamento técnico moderado e as habilidades necessárias em relação a técnicas alternativas.

Introduction

Espermatogénese mamíferos é considerado um processo sofisticado de células estaminais auto-renovação submetidos sucessivamente a mitose, meiose e a diferenciação, a fim de se desenvolver em espermatozóides maduros haplóide. Estas alterações morfológicas são orquestradas por diferentes tipos de células e, apesar das tentativas profundas, ainda não é possível para imitar esses processos de cultura de células de ^1,2. Portanto, as pesquisas sobre a espermatogênese até agora depende de organismos vivos como modelos in vivo. Em geral, os estudos de função gênica são geralmente baseados em animais transgênicos. No entanto, gerar e manter este tipo de modelo animal é demorado, dispendioso e muito elaborado. Isto é atribuído ao processo de criação de comprimento necessária para a geração e manutenção do transgene ao longo de gerações. Além disso, a manipulação genética de todo o organismo pela abordagem transgênicos ou knockout é propenso a causar danos fisiológicos ao direcionamento genes com funções essenciais em várias regiões, como por exemplo, fora do testículo ou sistemicamente.

Além disso, alguns métodos de transfecção transiente estão associados com alguns inconvenientes fundamentais. Por exemplo, desvantagens típicas de transferência de genes mediada por vírus são a provocação de possíveis reacções imunológicas e regulamentos de segurança adicionais, ao passo que a lipofecção ³ e ⁴ bombardeamento com micropartículas pode danificar o tecido e são limitados a uma certa profundidade da célula suficiente para a eficiência de transfecção.

Em contraste, electroporação (EP) como outra forma comum de transfecção transiente, parece constituir uma técnica promissora para permitir na transfecção in vivo e na análise de genes in vivo consistentes. Em geral, a EP é referido como um fenómeno dinâmico que depende da tensão transmembranar local com poros consequentemente mediadas dentro nanossegundos. Essas lacunas podem ser mantidos por milésimos de segundo, suficiente to conceder acesso ao DNA, RNA ou pequenas moléculas ^5. Quando a tensão aplicada for muito elevada, o carácter geralmente transiente de PE é contrariada, devido à produção de calor e de permeabilização de indução muito abrangente, com consequente dano irreversível da célula ^5.

Aqui, mostramos que a electroporação é um sistema de transfecção mais eficaz e económica, que é capaz de ser utilizado para a transformação genética do testículo, de modo a elucidar as características de genes in vivo testiculares. Este artigo aborda preparação plasmídeo, microinjeção via o ducto eferente ea eletroporação posterior de rato testículo. Este procedimento pode ser o meio de escolha para atingir a transfecção rápida, específica e eficaz de túbulos seminíferos de testículo do rato in vivo, a fim de investigar os processos de espermatogénese.

Protocol

Todos os experimentos com animais realizados foram aprovados pelo comitê local de ética (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Pomerânia Ocidental, Alemanha). 1. plasmídeo Preparação Para a preparação de plasmídeo, utilizar kits de purificação de plasmídeo (ver tabela de materiais) ou métodos semelhantes com tampão de remoção de endotoxinas de forma que as reacções imunitárias do animal podem ser evitadas. Siga as instr…

Representative Results

A configuração experimental para a realização de micro-injecção e de electroporação de testículo do rato in vivo, uma vez que é usado de acordo com o protocolo ilustrado na Figura 1. Embora seja possível para adquirir as micropipetas de fabrico industrial, que preferido para gerar os nossos próprios pipetas puxando (Figura 1A e) chanfradura (Figura 1B) capilares de vidro para se adequarem às necessidades. O equipamento para a microinjecção e elec…

Discussion

A investigação no campo da biologia reprodutiva, em especial na área da fertilidade masculina e, inevitavelmente, a espermatogénese depende de organismos vivos. A fim de examinar a função testicular, sem / sistema de cultura de células in vitro adequada foi estabelecida capaz de reflectir as alterações morfológicas importantes de um diplóide spermatogonium para um ^1,2 espermatozóide maduro haplóide. Assim, a geração de animais geneticamente modificados é muitas vezes …

Materials

centrifuge	Sigma	1-15 PK
spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
micromanipulator	homemade		XYZ cross table
surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
surgical suture	Catgut 00	Catgut Markenkirchen
syringe, with 30G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10x PBS, pH 7.4	Carl Roth	3957.1	NaCl [1.37 M]
6781.1	KCl [27 mM]
T106.2	Na2HPO4+2H2O [100 mM]
3904.1	KH2PO4 [18 mM]
10% Ketamin	Serum Werk Bernburg	Urotamin	mix in a rate 1:1
2% Xylazin	Serum Werk Bernburg	Xylazin
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
vet ointment	S&K Pharma GmbH	Kerato Biciron 5% Augensalbe	or similar to prevent dryness of eyes
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605