В Vivo микроинъекции и электропорации мыши яичка
Summary
В этой статье описывается микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как техника трансфекции для яичек мышиных клеток для изучения уникальных процессы сперматогенеза. Представленный протокол включает этапы подготовки стеклянной капиллярной, микроинъекции через выводного протока, и трансфекции путем электропорации.
Abstract
Этот вклад видео и статья дает исчерпывающее описание микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях. Это особая техника трансфекции для яичек клеток мыши позволяет изучение уникальных процессов в сперматогенеза.
Следующий протокол фокусируется на трансфекции яичка клеток мыши с плазмиды конструкций. В частности, мы использовали репортер вектор pEGFP-C1, который выражает повышенную зеленый флуоресцентный белок (EGFP), а также вектор pDsRed2-N1 выражая красный флуоресцентный белок (DsRed2). Оба закодированные гены-репортеры были под контролем цитомегаловируса человека раннего промотора-(CMV).
Для выполнения перенос гена в яичках мыши, репортер плазмидные конструкции вводятся в семенниках, живущих мышей. С этой целью, яичко из наркоза животное подвергается и сайт микроинъекции подготовлен. Наша предпочтительным местоминъекции отводящий канал, с конечном счете, подключенного рете семенников в качестве анатомического транспортного маршрута сперматозоидов между яичка и придатка яичка. Таким образом, заполнение семенных канальцах после микроинъекции превосходно управление и контроль за использованием окрашенных растворов ДНК. После наблюдения достаточное заполнение яичка его цветной структуры канальцев, орган электропорации. Это позволяет передавать раствора ДНК в клетках семенников. После 3 дней инкубации яичка удаляют и исследовали под микроскопом для зеленого или красного флуоресценции, иллюстрирующий успех трансфекции.
Как правило, этот протокол может быть использован для доставки ДНК-или РНК-конструкции в живой мыши яичка для того, чтобы (по) выражают или сбить генов, облегчая в функции гена естественных условиях анализа. Кроме того, он подходит для изучения репортер конструкции или предполагаемый ген РегулаТори элементы. Таким образом, основными преимуществами техники электропорации являются высокая производительность в сочетании с низким усилием, а также умеренного технического оборудования и навыков, необходимых по сравнению с альтернативными методами.
Introduction
Млекопитающих сперматогенез считается сложный процесс самообновляющихся стволовых клеток последовательно проходящих митоза, мейоза и дифференцировку в целях развития в зрелом гаплоидном сперматозоидов. Эти морфологические изменения в оркестровке различных типов клеток и, несмотря на глубокие попытки, до сих пор невозможно имитировать эти процессы в культуре клеток 1,2. Следовательно, исследование сперматогенеза до теперь полагается на живые организмы в качестве моделей для естественных. В общем, функции гена исследования, как правило, основаны на трансгенных животных. Тем не менее, создании и поддержании такой модели на животных является трудоемким, дорогостоящим и достаточно сложной. Это связано с требуемой длительного процесса размножения для создания и поддержания трансген над поколений. Кроме того, генетические манипуляции всего организма трансгенной или нокаутом подхода является склонны вызывать физиологические нарушения при ориентации гены с основных функций в нескольких регионах, например, за пределами яичка или системно.
Кроме того, некоторые переходные способы трансфекции связаны с некоторых важных недостатков. Например, типичные недостатки вируса-опосредованного переноса генов являются возможно провокация immunoreactions и дополнительных правил безопасности, в то время как липофекция 3 и бомбардировки микрочастицами 4 может привести к повреждению ткани и ограничены определенной глубине клеток для достаточной эффективности трансфекции.
В отличие от этого, электропорации (EP) в качестве еще одного общего пути временной трансфекции, кажется, представляют собой перспективный метод позволяет в естественных условиях трансфекции и последовательной естественных анализа генов в. В общем, ЕР называют динамическим явлением, которое зависит от местного трансмембранного напряжения с следовательно, опосредованных пор в пределах наносекунд. Эти пробелы можно поддерживать в течение миллисекунд, достаточно то предоставлении доступа к ДНК, РНК или малых молекул 5. Когда приложенное напряжение является слишком высокой, как правило, временный характер ЕР противодействует за счет производства тепла и индукции слишком комплексной проницаемости с последующей необратимого повреждения клетки 5.
Здесь мы показываем, что электропорации является эффективным и экономичным система трансфекции который способен быть использованы для генетической трансформации яичка с целью выяснения яичек характеристики генов в естественных условиях. В данной статье рассматриваются подготовку плазмиды, микроинъекции через выводного протока и последующей электропорации мыши яичка. Эта процедура может быть средством выбора для достижения быстрого, конкретную и эффективную трансфекцию семенных канальцах яичек мыши в естественных условиях с целью изучения процессов сперматогенеза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования в области репродуктивной биологии, особенно в области мужской фертильности и сперматогенеза неизбежно опирается на живые организмы. Для того чтобы исследовать функцию яичек, никакой адекватной культуры клеток системы / в пробирке не установлено способны о?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Биргит Westernstroeer Центра репродуктивной медицины и андрологии в Университете Мюнстера для преподавания микроинъекции яичек. Кроме того, мы благодарны Урсула Antkewitz и Петра Reckling для оказания технической помощи. Мы благодарим Немецкий исследовательский фонд (DFG) за поддержку этой работы (WE2458 / 10-1).
Materials
|
centrifuge |
Sigma | 1-15 PK | |
| spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder |
|
| fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| surgical suture | Catgut 00 | Catgut Markenkirchen |
|
| syringe, with 30G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10x PBS, pH 7.4 | Carl Roth | 3957.1 | NaCl [1.37 M] |
| 6781.1 | KCl [27 mM] | ||
| T106.2 | Na2HPO4+2H2O [100 mM] | ||
| 3904.1 | KH2PO4 [18 mM] | ||
| 10% Ketamin | Serum Werk Bernburg |
Urotamin | mix in a rate 1:1 |
| 2% Xylazin | Serum Werk Bernburg |
Xylazin | |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| vet ointment | S&K Pharma GmbH |
Kerato Biciron 5% Augensalbe |
or similar to prevent dryness of eyes |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 |
Referencias
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
