Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.
Bu video ve makale katkı mikroenjeksiyon ve in vivo fare testis elektroporasyon kapsamlı bir açıklamasını verir. Testis fare hücreleri için bu özel teknik transfeksiyon spermatogenez benzersiz süreçlerin çalışma sağlar.
Aşağıdaki protokol, plazmid yapıları ile fare testis hücrelerin transfeksiyonu odaklanmaktadır. Özellikle, kırmızı flöresanlı proteinin (DsRed2) ifade yeşil flüoresan protein (EGFP) ve ayrıca pDsRed2-N1 vektör geliştirilmiş ifade eden raportör vektör pEGFP-C1, ikinci. Her iki raportör genler kodlanan insan sitomegalovirüs hemen erken promoteri (CMV) kontrolü altındaydı.
Fare testislerinde gen transferini gerçekleştirmek için, raportör plasmid yapıları, canlı farelerde testis enjekte edilir. Bu amaçla, bir hayvan anestetize testis maruz kalmakta ve mikroenjeksiyon site hazırlanır. Bizim tercih yerienjeksiyon testis ve epididim arasında spermlerin anatomik taşıma rotası olarak sonuçta bağlı rete testis ile, efferent kanal olduğunu. Bu şekilde, mikro enjeksiyon sonrası seminifer tüp doldurma sayesinde mükemmel lekeli DNA çözeltilerinin kullanılması ile idare ve kontrol edilir. Onun renkli tübül yapısı ile testisin yeterli dolgu gözlemledikten sonra, organ elektropore edilmiştir. Bu testis hücrelere DNA solüsyonu aktarılmasını sağlar. Inkübasyon 3 gün sonra, testis çıkarılır ve transfeksiyon başarı gösteren, yeşil ve kırmızı floresans mikroskobu altında incelendi.
Genellikle, bu protokol DNA- ya RNA- teslim için kullanılabilir için canlı fare testisi içine inşa (over) ifade veya in vivo gen fonksiyon analizinde kolaylaştırılması, genleri yıkmak. Ayrıca, raportör gen ya da putatif düzenlenmesinden çalışmak için uygundurTory elemanları. Böylece, elektroporasyon tekniğinin ana avantajları, alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında Gerekli düşük çaba yanı sıra ılımlı teknik ekipman ve becerileri ile birlikte hızlı performans vardır.
Memeli spermatogenez olgun haploid sperm içine geliştirmek amacıyla art arda mitoz, mayoz ve farklılaşma geçiren kendini yenileyen kök hücrelerin karmaşık bir süreç olarak kabul edilir. Bu morfolojik değişiklikler, farklı hücre tipleri tarafından orkestra ve derin girişimlerine rağmen, hücre kültürü 1,2 bu süreçleri taklit hala imkansız. Dolayısıyla, bugüne kadar spermatogenez üzerine araştırmalar in vivo model olarak yaşayan organizmalar dayanır. Genel olarak, gen fonksiyonu çalışmalar, genellikle transgenik hayvanlarda dayanmaktadır. Bununla birlikte, üretme ve hayvan modellerinde bu tür sürdürülmesi zaman alıcı ve maliyet-yoğun ve oldukça karmaşıktır. Bu üreten ve nesiller boyunca transgen korumak için gerekli uzun yetiştirme süreci atfedilir. Buna ek olarak, transgenik ya da nakavt yaklaşım bütün organizmanın genetik manipülasyon g hedeflerken fizyolojik bozulmalara neden eğilimliÖrneğin birden fazla bölgelerde, temel işlevleri, testis dışında veya sistemik ile enes.
Bundan başka, bazı geçiş transfeksiyon yöntemleri bazı önemli dezavantajlar ile ilişkilidir. Lipofeksiyon 3 ve mikro-parçacık bombardımanı 4 dokuya zarar verebilir ve yeterli transfeksiyon verimi açısından belirli bir hücre derinliği ile sınırlıdır, oysa Örneğin, virüs aracılı gen transferi tipik dezavantajları, immün reaksiyonlar ve ilave güvenlik düzenlemelerinin olası provokasyon bulunmaktadır.
Buna karşılık, geçici nakiller başka bir ortak yolu olarak elektroporasyon (AP), in vivo nakil ve tutarlı in vivo gen analizi etkinleştirmek için umut verici bir teknik teşkil görünüyor. Genel olarak, AP nanosaniye olan sonuç olarak aracılı gözenek ile yerel zar gerilimine bağlı olarak dinamik bir olgu olarak adlandırılır. Bu boşluklar milisaniye boyunca muhafaza edilebilir, yeterli To DNA, RNA veya küçük moleküllerin 5 erişim izni. Uygulanan gerilim çok yüksek olduğunda, EP genellikle geçici karakteri nedeniyle ısı üretimi ve hücre 5 sonuçta geri dönüşümsüz hasar ile çok kapsamlı geçirgenleştirmeden indüksiyonu ile karşılaşmaktadır.
Burada, elektroporasyon in vivo gen testis özelliklerinin ortaya konması için genetik dönüşümü için uygulanan testis olma yeteneğine sahip bir etkin ve ekonomik bir transfeksiyon sistemi olduğunu göstermektedir. Bu makalede, götürücü kanal ve fare testis sonra elektroporasyon ile bir plazmid hazırlama işlemi, mikro-enjeksiyon giderir. Bu prosedür, spermatogenez işlemlerini incelemek için in vivo fare testis seminifer tüp hızlı, spesifik ve verimli transfeksiyona elde etmek için tercih edilen bir araç olabilir.
Özellikle erkek infertilitesi ve kaçınılmaz spermatogenez alanında üreme biyolojisi alanında, araştırma canlı organizmalar üzerinde dayanır. Testis işlevini incelemek amacıyla, yeterli hücre kültürü / in vitro bir sistem haploid olgun sperm 1,2 diploid spermatogonyum tüm önemli morfolojik değişiklikler yansıtma kapasitesine kurulmuştur. Böylece, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların üretimi genellikle gereklidir ve erkek üreme biyolojisi böyle değe…
The authors have nothing to disclose.
Biz testis mikroenjeksiyon öğretmek için Münster Üniversitesi Üreme Tıbbı ve Androloji Merkezi Birgit Westernstroeer teşekkür ederim. Ayrıca, biz Ursula Antkewitz ve teknik yardım için Petra reckling minnettarız. Biz bu işi (WE2458 / 10-1) desteklemek için Alman Araştırma Vakfı (DFG) teşekkür ederim.
centrifuge |
Sigma | 1-15 PK | |
spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder |
|
fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
surgical suture | Catgut 00 | Catgut Markenkirchen |
|
syringe, with 30G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
10x PBS, pH 7.4 | Carl Roth | 3957.1 | NaCl [1.37 M] |
6781.1 | KCl [27 mM] | ||
T106.2 | Na2HPO4+2H2O [100 mM] | ||
3904.1 | KH2PO4 [18 mM] | ||
10% Ketamin | Serum Werk Bernburg |
Urotamin | mix in a rate 1:1 |
2% Xylazin | Serum Werk Bernburg |
Xylazin | |
Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
vet ointment | S&K Pharma GmbH |
Kerato Biciron 5% Augensalbe |
or similar to prevent dryness of eyes |
To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 |