Mesure automatisée de l'emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
L'utilisation de modèles animaux pour étudier la MPOC est difficile, car aucun modèle ne peut parfaitement répliquer toutes les caractéristiques de la maladie humaine (2). La plupart des chercheurs utilisent la souris pour modéliser MPOC en raison des similitudes entre les souris et les humains dans leurs pulmonaires physiologie, la pathologie, la génétique, et des métabolites. En outre, les souris sont relativement peu coûteux à étudier, et à la fois l'emphysème et la petite remodelage des voies aériennes se développent dans les 6 mois de l'exposition CS (5,7-9).
Cigarette BPCO induite fumée: Plusieurs méthodes peuvent induire la MPOC chez les souris. La plupart des chercheurs exposent souris au CS, qui est le principal facteur étiologique de la MPOC humaine. CS exposition pendant 6 mois provoque le développement de l'emphysème et la petite remodelage des voies aériennes (SAR) chez la souris, mais la gravité de la maladie qui est induite varie en fonction de la souche murine étudié. Par exemple, des souris NZWLacZ sont résistants au développement de l'emphysème induit par CS alors que les souris AKR / J sont extremely sensible (10). La plupart des chercheurs étudient C57BL / 6 souris de souche dans le modèle d'exposition CS autant de souris génétiquement ciblée sont disponibles dans cette souche. Après six mois de l'exposition CS, l'emphysème et la fibrose petite des voies respiratoires se développent dans de type sauvage (WT) souris C57BL / 6, et les deux lésions sont relativement doux dans la sévérité (5,10). Les chercheurs utilisent deux types de CS exposition: expositions nez seul et l'ensemble du corps. Les principaux inconvénients de la seule nez technique d'exposition sont les suivantes: 1) ce est une méthode plus de main-d'œuvre; et 2) les souris doivent être retenus dans de petites chambres qui peuvent induire une réponse au stress et l'hyperthermie chez les animaux (11). L'inconvénient majeur de l'exposition du corps entier (décrit ici) est que les animaux peuvent ingérer (ainsi que inhalent) nicotine et en goudrons produits quand ils nettoient leur fourrure. Souris exposées à l'ensemble du corps CS ont également des niveaux de carboxyhémoglobine inférieurs et réduit la perte de poids corporel par rapport à des animaux exposés à nez seulement CS (12).
<p class = "jove_content"> test de la fonction pulmonaire (PFT): mesures de la compliance pulmonaire et élastance sont généralement similaires chez les souris C57BL / 6 de type sauvage (WT) les souris exposées à l'air ou CS pour six mois en raison de l'emphysème relativement doux qui se développe lorsque cette souche est exposé à CS (10). Toutefois, lorsque la destruction est plus sévère emphysémateux, l'augmentation de la compliance pulmonaire et des changements dans la gauche pression-volume (PV) se écoulent boucles peuvent être détectés. Celui-ci peut être observé, par exemple, dans des souches de souris qui sont plus sensibles aux effets de CS (10), chez les souris du gène ciblé CS-exposées C57BL / 6 souches qui ont un type d'emphysème plus sévère que / 6 souris WT C57BL (13), ni chez les souris CS-exposées soumises à des changements environnementaux qui les rendent plus sensibles aux effets de CS (14). Ce protocole utilise un petit ventilateur animal à mesurer les réductions dans le recul élastique du poumon (augmentations de la compliance pulmonaire quasi-statique [l'agent] et des réductions dans les tissusélastance [H]), boucles d'écoulement de PV, et les changements dans les voies aériennes et des tissus résistance chez la souris anesthésiés (15,16).Mesures de l'emphysème pulmonaire: Analyse du développement de l'emphysème dans CS-exposée C56BL / 6 souris de souche est difficile parce que sa distribution est spatialement hétérogène. Plusieurs méthodes différentes quantifier l'élargissement de l'espace aérien chez la souris. La première méthode utilisée est le point d'intersection linéaire moyenne (L m) (17). Cependant, la méthode L m est un processus manuel lent qui ne peuvent pas capturer l'hétérogénéité de la maladie (si toutes les sections du poumon sont échantillonnées au hasard) et son utilisation peut donc introduire des biais de l'observateur dans l'analyse. L'indice destructive [DI, (18)] quantifie également l'élargissement de l'espace aérien à l'aide d'une feuille transparente avec 50 points également répartis placés sur une image numérisée d'un imprimé à l'hématoxyline et l'éosine section du poumon teinté. La méthode de PI scores la région entourant chaque point accordage à la mesure dans laquelle les canaux alvéolaires et des parois alvéolaires dans cette zone sont détruits. Le principal inconvénient de la méthode de DI est qu'il prend beaucoup de temps et pas plus précis que d'autres procédés (19,20).
Ce protocole de mesures signifient alvéolaire longueur de corde et de la zone alvéolaire sur les sections pulmonaires paraffine colorées avec la coloration de Gill. logiciel de Morphométrie convertit les images de sections du poumon à des images binaires (dans lequel le tissu est blanc et l'espace aérien est noir), puis superpose une grille uniforme de lignes horizontales et verticales (accords) et le logiciel quantifie alors la longueur de chaque accord dans les domaines identifiés par logiciel comme espace aérien. En utilisant cette méthode, il est possible de mesurer la taille des alvéoles dans toutes les régions du poumon d'une manière relativement uniforme et automatisé (21).
Petit remodelage des voies aériennes (SAR): Le dépôt accru de protéines ECM (surtout de intersticesl collagènes) autour de petites voies aériennes se produit chez les animaux exposés au CS et contribue à une obstruction. Les chercheurs ne étudient pas SAR dans des modèles animaux de la MPOC aussi souvent que le développement de l'emphysème (22). Pour quantifier SAR chez les souris CS-exposées, ce protocole utilise un logiciel d'analyse d'image pour mesurer l'épaisseur de la couche de protéines de la MEC qui se dépose autour des petites voies respiratoires (voies respiratoires ayant un diamètre moyen compris entre 300 et 899 m) dans des coupes de poumon inclus dans la paraffine colorées avec trichrome de Masson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Francesca Polverino MD, chercheur à l'hôpital Brigham and Women pour sa contribution à cet article, ainsi que Monica Yao, BS, et Kate Rydell, BS pour leur aide à l'élevage de souris et en exposant la souris à la fumée de cigarette.
Ce travail a été soutenu par le Service de la santé publique, National Heart, Lung, and Blood Institute Subventions HL111835, HL105339, HL114501, les agents de bord Institut de recherche médicale Grant # CIA123046, l'Hôpital Brigham and-Lovelace Respiratory Research Institute Consortium des femmes, et de la Cambridge NIHR biomédicale Centre de recherche.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referencias
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