מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד COPD הוא מאתגר, כי אין מודל מושלם יכול לשכפל את כל התכונות של המחלה האנושית (2). רוב החוקרים משתמשים בעכברי מודל COPD בגלל הדמיון בין עכברים ובני האדם בפיסיולוגיה, פתולוגיה, הגנטיקה, ומטבוליטים הריאות שלהם. כמו כן, עכברים זולים יחסית ללמוד, ושניהם אמפיזמה ושיפוץ של דרכי הנשימה קטנה לפתח בתוך 6 חודשים מהחשיפה CS (5,7-9).
COPD מושרה עשן סיגריות: מספר שיטות יכולות לגרום ל- COPD בעכברים. רוב החוקרים לחשוף עכברים לCS, המהווה את הגורם האטיולוגי העיקרי לCOPD האנושי. חשיפת CS במשך 6 חודשים גורמת להתפתחות של אמפיזמה ושיפוץ בדרכי נשימה קטנה (SAR) בעכברים, אך חומרת המחלה הנגרמת משתנה בהתאם לזן העכברי למד. לדוגמא, עכברי NZWLacZ עמידים להתפתחות של אמפיזמה הנוצרת על-CS ואילו עכברי AKR / J הם extremel y רגיש (10). רוב החוקרים ללמוד C57BL / 6 עכברי זן במודל חשיפת CS עכברים-ממוקד גן רבים זמינים בזן זה. לאחר 6 חודשים של חשיפת CS, אמפיזמה וסיסטיק דרכי הנשימה הקטן לפתח בסוג בר C57BL (WT) / 6 עכברים, והן הנגעים מתונים יחסית בחומרה (5,10). חוקרים משתמשים בשני סוגים של חשיפת CS: חשיפות האף בלבד וכל גוף. החסרונות העיקריים של האף-רק טכניקת החשיפה הם כי: 1) הוא שיטה עתירת עבודה יותר; ו 2) עכברים צריכים להיות מרוסנים בתאים קטנים שיכול לגרום לתגובת לחץ והיפרתרמיה בבעלי החיים (11). החסרון העיקרי של חשיפת כל הגוף (שתתואר בהמשך) הוא שבעלי החיים יכולים לבלוע (כמו גם שאיפה) מוצרי ניקוטין וזפת כאשר הם לנקות את פרוותם. עכברים שנחשפו לכל הגוף CS יש גם רמות נמוכות carboxyhemoglobin ומופחתים אובדן משקל גוף בהשוואה לבעלי החיים שנחשפו לאף-רק CS (12).
<p class = "jove_content"> בדיקת תפקוד ריאתי (PFTS): צעדים של עמידת ריאות וelastance הם בדרך כלל דומים ב/ 6 סוג בר C57BL (WT) עכברים שנחשפו לאוויר או CS במשך 6 חודשים עקב נפחת קל יחסית שמתפתח כאשר זה זן חשוף לCS (10). עם זאת, כאשר הרס emphysematous הוא חמור יותר, עולה בקנה אחד ריאות ומשמרות שמאל בלחץ-הנפח (PV) לזרום ניתן לאתרם לולאות. האחרונים יכול להיות שנצפה, למשל, בזנים עכבריים שרגישים יותר להשפעות של CS (10), בעכברים שנחשפו-CS C57BL / 6 זן-ממוקד גן שיש לי סוג אמפיזמה חמור יותר מ/ 6 עכברי WT C57BL (13), או בעכברים שנחשפו-CS נתון לשינויים סביבתיים ההופכים אותם רגישות יותר להשפעות של CS (14). פרוטוקול זה משתמש הנשמה חיה קטנה למדידת ירידה ברתיעה אלסטית של הריאה (עליות בעמידת ריאות quasistatic [CST] וירידה ברקמהelastance [ח]), זרימת לולאות PV, ושינויים בהתנגדות בדרכי נשימה ורקמות בעכברים מורדמים (15,16).מדדים של אמפיזמה ריאתית: ניתוח של התפתחות נפחת בעכברי זן C56BL / 6 חשופים-CS הוא מאתגרים בגלל ההפצה שלה היא במרחב הטרוגנית. כמה שיטות שונות לכמת הגדלת מרחב אווירי בעכברים. השיטה הראשונה בה השתמשה הייתה ליירט ליניארי (מ 'L) הממוצע (17). עם זאת, השיטה מ 'L היא תהליך איטי, הוראות אשר לא יכול ללכוד את ההטרוגניות של המחלה (אלא אם כן את כל החלקים של ריאות נדגמים באופן אקראי) והשימוש בו עשוי אפוא להציג את ההטיה משקיף לניתוח. המדד ההרסני [DI, (18)] גם מכמת הגדלת מרחב אווירי באמצעות גיליון שקוף עם 50 נקודות תחולקנה בצורה שווה ממוקמות מעל תמונת דיגיטציה מודפסת של hematoxylin וסעיף ריאות מוכתמת eosin. ציוני שיטת PI הסביבה כל ac נקודהcording למידה שבה צינורות alveolar וקירות מכתשי באזור זה נהרסו. החסרון העיקרי של שיטת DI הוא שזה גוזל זמן ולא מדויק יותר מאשר בשיטות אחרות (19,20).
צעדי פרוטוקול זה אומר אורך alveolar אקורד ואזור מכתשי בחלקי ריאה-מוטבע פרפין מוכתמים בכתם של גיל. תוכנת Morphometry ממירה תמונות של חלקי ריאה לתמונות בינארי (שברקמה לבנה ובמרחב אווירי הוא שחור), ולאחר מכן כופה את רשת אחידה של קווים אופקיים ואנכיים (אקורדים) והתוכנה אז מכמתת את אורכו של כל אקורד בתוך האזורים שזוהו על ידי תוכנה כמרחב אווירי. באמצעות שיטה זו, ניתן למדוד את גודלו של alveoli בכל חלקי הריאה באופן סטנדרטי ויחסית אוטומטי (21).
שיפוץ קטן בדרכי נשימה (SAR): בתצהיר המוגבר של חלבוני ECM (במיוחד interstitiacollagens l) סביב דרכי הנשימה קטנות מתרחש בבעלי חיים שנחשפו-CS ותורם לזרימת אוויר חסימה. חוקרים לא לומדים SAR במודלים של בעלי חיים של COPD באותה תדירות כמו פיתוח אמפיזמה (22). כדי לכמת SAR בעכברים שנחשפו-CS, פרוטוקול זה משתמש בתוכנת ניתוח תמונה למדוד את עובי השכבה של חלבוני ECM שהופקדה סביב דרכי הנשימה הקטנות (דרכי הנשימה שקוטר ממוצע בין 300 ל 899 מ ') בסעיפי ריאה-מוטבע פרפין מוכתם בכתם Trichrome של האסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות פרנצ'סקה Polverino MD, עמית מחקר בריגהם ובית החולים לנשים על תרומתה למאמר זה, וגם מוניקה יאו, BS, וקייט Rydell, BS לסיוע שלהם עם בעלי עכבריים וחשיפת העכברים לעשן סיגריות.
עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות ציבור, לאומי ללב, ריאות ודם מכון המענקים HL111835, HL105339, HL114501, טיסת לויה מכון המחקר הרפואי גרנט # CIA123046, Brigham and נשים מחקר הנשימה החולים-לאבלייס מכון Consortium, וNIHR ביו-רפואי קיימברידג ' מרכז מחקר.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referencias
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
