Автоматическое измерение эмфиземы легких и малых дыхательных путей Ремоделирование в сигаретном дыме, подвергшихся воздействию мышей
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
Использование животных моделей для изучения ХОБЛ является сложной задачей, потому что ни одна модель не может идеально повторить все особенности человеческого заболевания (2). Большинство исследователей использовать мышей для моделирования ХОБЛ из-за сходства между мышами и людьми в их легких физиологии, патологии, генетики и метаболитов. Кроме того, мыши являются относительно недорогими, чтобы учиться, и как эмфизема и малых ремоделирования дыхательных путей развиваются в течение 6 месяцев CS экспозиции (5,7-9).
Сигаретный дым, вызванных ХОБЛ: Несколько методов могут вызвать ХОБЛ у мышей. Большинство исследователей подвергайте мышей CS, которая является основным этиологическим фактором для человеческого ХОБЛ. CS экспозиции в течение 6 месяцев вызывает развитие эмфиземы и небольшое ремоделирования дыхательных путей (SAR) у мышей, но тяжесть заболевания, которые индуцируют варьируется в зависимости от мышиного штамма исследуемого. Например, у мышей NZWLacZ устойчивы к развитию CS-индуцированной эмфиземы, тогда как AKR / J мышей extremelу чувствительных (10). Большинство исследователей изучать C57BL / 6 деформации мышей в модели экспозиции CS, как многие ген-направленных мышей доступны в этом штамме. После 6 месяцев CS экспозиции, эмфиземы и небольшой фиброз дыхательных путей развиваться в дикого типа (WT) C57BL / 6 мышей, и оба поражения в относительно легкой степени тяжести (5,10). Исследователи используют два типа CS воздействия: нос только и всего тела экспозиций. Основные недостатки: Только нос техники экспозиции в том, что: 1) это еще один способ трудоемкий; и 2) у мышей должны быть ограничены в небольших камерах, которые могут вызывать реакцию на стресс и гипертермии у животных (11). Основным недостатком экспозиции всего тела (описанного здесь), что животные могут поглощать (а также вдоха) никотина и смолы продуктов, когда они очистить их меха. Мышей, подвергнутых всего тела CS также имеют более низкий уровень карбоксигемоглобина и уменьшить потерю массы тела по сравнению с животными воздействию носа-только CS (12).
<p claсс = "jove_content"> тест легочной функции (ПФТС): Меры податливости легких и эластичности, как правило, похожи на C57BL / 6 дикого типа (WT) мышей воздействию воздуха или CS в течение 6 месяцев в связи с относительно мягкой эмфиземы, которая развивается, когда это Штамм подвергается CS (10). Однако, когда эмфизематозный разрушение более серьезными, увеличение эластичности легких и левых сдвигов в давление-объем (PV) текут петли могут быть обнаружены. Последнее можно наблюдать, например, в мышиных штаммов, которые более восприимчивы к воздействию CS (10), в CS-инфицированными / 6 деформации ген-направленных мышей C57BL, которые имеют более тяжелые эмфизема, чем C57BL / 6 дикого мышей (13), или в CS-инфицированными мышей, подвергнутых воздействию экологических изменений, которые делают их более восприимчивыми к воздействию CS (14). Этот протокол использует маленькое животное вентилятор для измерения сокращения в упругой отдачи легких (увеличение квазистатическом податливости легких [сСт] и уменьшение тканиэластичность [H]), контуров движения PV, и изменения в дыхательных путях и тканевой резистентности наркозом мышей (15,16).Меры эмфиземы легких: Анализ развития эмфиземы в CS-открытой C56BL / 6 деформации мышей является сложной задачей, поскольку его распределение в пространстве неоднородна. Существует несколько методов количественной оценки воздушного пространства расширение у мышей. Первый способ использовали среднее линейное перехвата (L м) (17). Тем не менее, способ Л М представляет собой медленный, ручной процесс, который не может захватить гетерогенность заболевания (если все участки легких не случайным образом отобранных) и, следовательно, его использование может привести к систематической ошибке наблюдателя в анализе. Разрушительное индекс [Д.И., (18)] и количественно воздушного пространства расширение с помощью прозрачного листа с 50 равномерно распределенных точек, расположенных над печатной оцифрованного образа гематоксилином и эозином окрашенных разделе легких. Оценки метод PI районе, прилегающем к каждой точке переменного токаПеретяжка в той мере, которая альвеолярные протоки и альвеолярных стенок внутри этой области уничтожены. Основным недостатком метода DI является то, что отнимает много времени и не более точными, чем другие методы (19,20).
Этот протокол меры означают альвеолярного длину хорды и альвеолярной области на парафиновых срезах легких, окрашенных красителем Гилла. Морфометрия программное обеспечение преобразует изображения срезах легких в бинарных изображений (в которой ткань белого цвета, воздушное пространство черный), а затем накладывает на равномерной сетке горизонтальных и вертикальных линий (аккорды), а затем программное обеспечение количественно длину каждого аккорда в областях, определенных программное обеспечение как в воздушном пространстве. С помощью этого метода, можно измерить размер альвеол во всех частях легких в стандартной и относительно автоматическом режиме (21).
Малый ремоделирования дыхательных путей (SAR): увеличена осаждение белков ВКМ (особенно interstitiaл коллагены), вокруг малых дыхательных путей происходит в CS-инфицированными животными и способствует обструкции дыхательных путей. Исследователи не изучают SAR в животных моделях ХОБЛ так часто, как развитие эмфиземы (22). Для количественной оценки SAR в CS-облученных мышей, этот протокол использует программное обеспечение анализа изображений для измерения толщины слоя белков ЕСМ, который откладывается вокруг малых дыхательных путей (дыхательных путей, имеющих средний диаметр между 300 и 899 м) в парафин срезах легких окрашивали трихромом пятно Массона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Франческа Польверино доктор медицинских наук, научный сотрудник Бригама и женской больницы за ее вклад в эту статью, а также Моника Яо, BS, и Кейт Rydell, BS за помощь в мышиной хозяйства и подвергая мышей сигаретного дыма.
Эта работа была поддержана Государственной службы здравоохранения, Национальный институт сердца, легких и крови институт грантов HL111835, HL105339, HL114501, бортпроводники Института медицинских исследований грант № CIA123046, Бригама и Женской больницы-Лавлейс органов дыхания НИИ консорциума, и Кембриджского NIHR Biomedical Научно-исследовательский центр.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referencias
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
