Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

Summary

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Abstract

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020⁽¹⁾. Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs⁽²⁾. However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD^(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients⁽⁶⁾, but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

Introduction

O uso de modelos animais para estudar a DPOC é um desafio, porque nenhum modelo pode perfeitamente replicar todas as características da doença humana ^(2). A maioria dos investigadores usar ratos para modelar DPOC causa das semelhanças entre ratos e seres humanos em suas pulmonares fisiologia, patologia, genética e metabólitos. Além disso, os ratos são relativamente baratos para estudar, e ambos enfisema e remodelação das vias aéreas pequenas desenvolver dentro de 6 meses de exposição CS ^(5,7-9).

Cigarro COPD induzida pelo fumo: Vários métodos podem induzir DPOC em camundongos. A maioria dos pesquisadores expor ratos para CS, que é o principal fator etiológico para a DPOC humano. CS exposição durante 6 meses faz com que o desenvolvimento de enfisema e remodelação das vias aéreas pequenas (SAR) em ratos, mas a gravidade da doença que é induzida varia dependendo da estirpe murina estudado. Por exemplo, ratinhos NZWLacZ são resistentes ao desenvolvimento de enfisema induzido por CS enquanto que os ratinhos AKR / J são extremely sensível ^(10). A maioria dos investigadores estudar camundongos C57BL / 6 tensão no modelo de exposição CS como muitos ratos alvo de genes estão disponíveis nesta estirpe. Após 6 meses de exposição CS, enfisema e fibrose das vias aéreas pequenas desenvolver no tipo selvagem (WT) murganhos C57BL / 6, e as duas lesões são relativamente leves em termos de gravidade ^(5,10). Pesquisadores usam dois tipos de exposição CS: nose-somente e de corpo inteiro exposições. As principais desvantagens do nariz só de técnica de exposição são de que: 1) é um método mais trabalhoso; e 2) os ratos têm que ser contido em pequenas câmaras que podem induzir uma resposta ao estresse e hipertermia nos animais ^(11). A principal desvantagem da exposição de todo o organismo (descrito aqui) é que os animais possam ingerir (bem como inspirar) nicotina e de alcatrão produtos quando eles limpar sua pele. Ratos expostos a todo o organismo CS também possuem níveis de carboxihemoglobina inferiores e perda de peso corporal reduzido quando comparados com animais expostos ao nariz só de CS ^(12).

<p class = "jove_content"> teste de função pulmonar (TFP): Medidas de complacência pulmonar e elastância são geralmente semelhantes em camundongos C57BL / 6 do tipo selvagem (WT) camundongos expostos ao ar ou CS por 6 meses, devido ao enfisema relativamente suave que se desenvolve quando este estirpe é exposto a CS ^(10). No entanto, quando a destruição enfisematosa é mais grave, os aumentos da complacência pulmonar esquerda e mudanças na pressão-volume (PV) de fluxo laços podem ser detectados. Este último pode ser observado, por exemplo, em estirpes de murinos que são mais susceptíveis aos efeitos de SC ^(10), em ratinhos alvo de gene CS-expostos estirpe C57BL / 6 que têm um tipo de enfisema mais grave do que ratinhos C57BL / 6 WT ^(13), ou em ratos expostos CS-sujeitas a alterações ambientais que os tornam mais susceptíveis aos efeitos de SC ^(14). Este protocolo usa um ventilador para pequenos animais para medir reduções no recolhimento elástico dos pulmões (aumento da complacência pulmonar quasiestático [Cst] e reduções em tecidoelastância [H]), loops de fluxo PV, e as mudanças na resistência das vias aéreas e do tecido em ratos anestesiados ^(15,16).

Medidas de enfisema pulmonar: Análise do desenvolvimento enfisema em CS-exposta C56BL / 6 ratos estirpe é um desafio, porque sua distribuição é espacialmente heterogêneo. Vários métodos diferentes quantificar o alargamento do espaço aéreo em camundongos. O primeiro método usado foi a intercepção linear média (L _m) ^(17). No entanto, o método L, _m é um processo manual e lento que não pode captar a heterogeneidade da doença (a não ser que todas as secções do pulmão são amostrados aleatoriamente) e a sua utilização pode, por conseguinte, apresentar preconceito do observador para a análise. O índice destrutiva [DI, ^(18)], também quantifica o alargamento do espaço aéreo usando uma folha transparente com 50 pontos distribuídos igualmente colocados sobre uma imagem digitalizada impressa de uma secção do pulmão corado com hematoxilina-eosina e. O método PI pontuações a área ao redor de cada ponto de acgundo a medida em que as condutas alveolares e paredes alveolares dentro desta área sejam destruídos. A principal desvantagem do método DI é que é demorada e não mais preciso do que outros métodos ^(19,20).

Este medidas de protocolo significa comprimento da corda alveolar e área alveolar em secções de pulmão embebidos em parafina coradas com a técnica de Gill. Morfometria software converte imagens de secções de pulmão para imagens binárias (em que o tecido é branco e do espaço aéreo é preto), e depois sobrepõe uma grade uniforme de linhas horizontais e verticais (cordas) e, em seguida, o software quantifica a duração de cada acorde dentro de áreas identificadas pelo software como o espaço aéreo. Usando este método, é possível medir o tamanho dos alvéolos em todas as partes do pulmão de uma forma padronizada e relativamente automatizada ^(21).

Remodelamento das vias aéreas Pequeno (SAR): O aumento da deposição de proteínas da MEC (especialmente interstitial colágenos) em torno de pequenas vias aéreas ocorre em animais CS-expostas e contribui para o fluxo de ar de obstrução. Os pesquisadores não estudam SAR em modelos animais de DPOC tão freqüentemente quanto o desenvolvimento do enfisema ^(22). Para quantificar SAR em ratinhos CS-expostos, este protocolo utiliza software de análise de imagem para medir a espessura da camada de proteínas da MEC que se deposita em volta das pequenas vias aéreas (vias respiratórias, com um diâmetro médio entre 300 e 899 m) em secções de pulmão embebidos em parafina corados com tricrômico de Masson.

Protocol

O protocolo tem ~ 25 semanas para ser concluído. O protocolo de ratinhos ao ar ou fumo expostos durante 24 semanas. No final das posições de fumo, as medidas de protocolo da função pulmonar nos ratos, e os pulmões são insuflados a uma pressão fixa, fixa, e retirados no mesmo dia. É necessário mais tempo para o pesquisador para incorporar, corte e coloração das secções de pulmão (2-3 dias), e captura e analisar as imagens (2-4 dias, dependendo do número de animais estudados). Este protocolo pode igualmente ser utilizado para …

Representative Results

Este protocolo começa com a exposição de todo o organismo de camundongos para CS. Supervisão e manutenção do dispositivo e monitoramento de TPM adequada conta garantir exposições de fumaça consistentes (Figura 1). É importante que o investigador se pratica a técnica de insuflação pulmonar usando o dispositivo de insuflação Este protocolo começa com a exposição de todo o organismo de camundongos para CS. Supervisão e manutenção do dispositivo e monitorame…

Discussion

Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.

There are several critical steps in this protocol. First, dur…

Materials

Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032