Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
Die Verwendung von Tiermodellen zu untersuchen COPD ist schwierig, weil kein Modell perfekt zu allen Funktionen des menschlichen Krankheit (2) zu replizieren. Die meisten Forscher verwenden Mäuse COPD aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen Mäusen und Menschen in ihrem Lungen Physiologie, Pathologie, Genetik und Metaboliten zu modellieren. Auch sind Mäuse relativ kostengünstig zu studieren, und beide Emphysem und kleinen Umbau der Atemwege entwickeln sich innerhalb von 6 Monaten nach CS Exposition (5,7-9).
Zigarettenrauch induzierten COPD: Verschiedene Methoden können COPD in Mäusen zu induzieren. Die meisten Forscher entlarven Mäuse CS, die die Haupt ätiologischer Faktor für die menschliche COPD ist. CS Exposition für 6 Monate bewirkt, dass die Entwicklung von Emphysem und der kleinen Atem Remodellierung (SAR) in Mäusen, aber die Schwere der Krankheit, die induziert wird, variiert in Abhängigkeit von dem murinen Stamm untersucht. Zum Beispiel sind NZWLacZ Mäuse resistent gegen die Entwicklung von CS-induzierte Emphysem wohin AKR / J-Mäuse sind extremely empfindlich (10). Die meisten Forscher studieren C57BL / 6-Mäuse-Stamm in der CS-Expositionsmodell so viele Gen-Targeting-Mäuse sind in dieser Sorte zur Verfügung. Nach 6 Monaten der CS Exposition, Emphysem und der kleinen Atemwege Fibrose in Wildtyp zu entwickeln (WT) C57BL / 6 Mäusen, und beide Läsionen sind in der Schwere (5,10) relativ mild. Die Forscher nutzen zwei Arten von CS Exposition: Nase nur und Ganzkörperaufnahmen. Die Hauptnachteile der Nase nur Aufnahmetechnik sind, dass: 1) es ist ein arbeitsintensiver Verfahren ist; und 2) Mäuse müssen in kleine Kammern, die eine Stress-Reaktion und Hyperthermie in der Tiere (11) veranlassen können zurückgehalten werden. Der größte Nachteil der Ganzkörperexposition (hier beschrieben) ist, dass die Tiere sich nehmen (wie auch inhalieren) Nikotin und Teer-Produkte, wenn sie ihr Fell zu reinigen. Mäuse von Ganzkörper-CS ausgesetzt haben auch eine geringere Carboxyhämoglobin und ein geringeres Körpergewichtsverlust, wenn sie mit Tier Nasen nur CS (12) ausgesetzt ist, verglichen.
<p class = "jove_content"> Lungenfunktionsprüfung (PFT): Maßnahmen der Lungencompliance und Elastance sind in der Regel ähnlich in C57BL / 6-Wildtyp (WT) Mäusen aufgrund der relativ milden Emphysem, dass, wenn dieses entwickelt, um Luft oder CS für 6 Monate ausgesetzt Stamm auf CS (10) ausgesetzt ist. Wenn jedoch emphysematous Zerstörung schwerere, Erhöhung der Lungencompliance und Linksverschiebungen in der Druck-Volumen (PV) zu fließen, Schleifen detektiert werden kann. Letzteres kann beobachtet werden, beispielsweise in Mausstämme, die anfällig für die Auswirkungen von CS (10) sind, in CS-belichteten C57BL / 6-Stamm Gen-Targeting-Mäusen, die eine schwerere Emphysem Typ als C57BL / 6-Mäuse haben WT (13) oder in CS-exponierten Mäusen gegenüber Umweltveränderungen, die sie anfällig für die Auswirkungen von CS (14) zu machen unterzogen. Dieses Protokoll verwendet einen kleinen Tierbeatmungsgerät Rabatte der elastischen Rückstoß der Lunge (Anstieg der quasistatischen Lungencompliance [Cst] und Ermäßigungen in Gewebe zu messenElastanz [H]), PV Strömungsschleifen, und Veränderungen in den Atemwegen und Gewebefestigkeit bei anästhesierten Mäusen (15,16).Maßnahmen von Lungenemphysem: Analyse von Emphysem Entwicklung CS-exponierten C56BL / 6-Mäuse-Stamm ist eine Herausforderung, da ihre Verteilung ist räumlich heterogen. Mehrere verschiedene Methoden zu quantifizieren Luftraumvergrößerung bei Mäusen. Das erste Verfahren verwendet wurde, war die mittlere Linearabschnitt (L m) (17). Ist die L m Verfahren jedoch eine langsame, manuelle Prozess, der die Heterogenität der Erkrankung (es sei denn, alle Abschnitte der Lunge zufällig abgetastet) und seine Verwendung kann daher Beobachter Bias einführen in die Analyse nicht erfassen können. Die Zerstörungsindex [DI, (18)] quantifiziert auch Luftraum Erweiterung mit einem transparenten Blatt mit 50 gleichmäßig verteilten Punkten über einer gedruckten digitalisierten Bild einer Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Lungenabschnitt platziert. Die PI-Verfahren erzielt das Gebiet um jeden Punkt acCording in dem Maße, in dem die Alveolargänge und Alveolarwände in diesem Bereich werden zerstört. Der Hauptnachteil des DI-Methode ist, dass es zeitaufwendig und genauer als andere Verfahren (19,20).
Dieses Protokoll Maßnahmen bedeuten alveolären Sehnenlänge und Alveolarbereich auf Paraffin eingebettete Lungenschnitten mit Gills Fleck befleckt. Morphometrie Software wandelt Bilder von Lungenschnitten auf binäre Bilder (in dem Gewebe ist weiß und Luftraum ist schwarz), und dann überlagert ein einheitliches Raster aus horizontalen und vertikalen Linien (Akkorde) und die Software quantifiziert dann die Länge der einzelnen Saite in Gebieten identifiziert Software als Luftraum. Mit dieser Methode ist es möglich, die Größe der Alveolen in allen Teilen der Lunge in einer standardisierten und relativ automatisierte Weise (21) zu messen.
Kleine Umbau der Atemwege (SAR): Die erhöhte Ablagerung von ECM-Proteinen (insbesondere interstitial Kollagene) um kleinen Atemwege erfolgt im CS-exponierten Tieren und trägt zu einer Behinderung des Luftstroms. Forscher nicht SAR im Tiermodell der COPD so oft wie Emphysem Entwicklung (22) zu studieren. SAR in CS-exponierten Mäusen quantifizieren, verwendet dieses Protokoll, Bildanalyse-Software, um die Dicke der Schicht aus ECM-Proteinen, die in der Umgebung der kleinen Atemwege (Atemwege mit einem mittleren Durchmesser zwischen 300 und 899 m) in Paraffin eingebetteten Lungenschnitten aufgebracht wird gemessen mit Masson-Trichrom-Färbung gefärbt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Francesca Polverino MD, wissenschaftlicher Mitarbeiter am Brigham and Women s Hospital für ihren Beitrag zu diesem Artikel danken und auch Monica Yao, BS, und Kate Rydell, BS für die Unterstützung bei murinen Haltung und Aussetzen der Mäuse gegenüber Zigarettenrauch.
Diese Arbeit wurde vom Public Health Service, National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL111835, HL105339, HL114501, Flugbegleiter Medical Research Institute Grant # CIA123046, der Brigham und Krankenhaus-Lovelace Respiratory Research Institute Consortium Frauen und der Cambridge NIHR Biomedical unterstützt Forschungszentrum.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referencias
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