البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub> 2</sub> العاهل<sub> 2</sub> مجالات الزنك الاصبع
Summary
المجالات الزنك الاصبع هي في جوهرها خلايا قابلة للاختراق وقادرة على التوسط تسليم البروتين في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الثديية. هنا، يتم تقديم خطوة بخطوة بروتوكول مفصلة لتنفيذ تكنولوجيا الزنك والإصبع للداخل الخلايا تسليم البروتين.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
استراتيجيات فعالة للغاية وتنوعا تسليم البروتين حاسمة بالنسبة لكثير من البحوث الأساسية والتطبيقات العلاجية. النقل المباشر لتنقية البروتينات في خلايا يمثل واحدة من أسلم وأسهل الطرق لتحقيق ذلك. وخلافا 1،2 الاستراتيجيات التي تعتمد على التعبير الجيني من الأحماض النووية، 3-5 تسليم البروتين يشكل أي خطر من الطفرات إقحامي، مستقلة عن الخلوية النسخ / الآلات الترجمة وتسمح لها تأثير فوري. ومع ذلك، فإن عدم وجود طرق بسيطة وللتعميم عن ومنح النشاط لاختراق الخلية على البروتينات يفند بشكل روتيني دخولهم المباشر في الخلايا. تستند الأساليب الحالية لتسهيل داخل الخلايا تسليم البروتين على استخدام تحدث بشكل طبيعي 6-8 أو تصميم الببتيد اختراق الخلية، 9-12 المجالات التنبيغ السوبر، 13،14 النانوية 15 والجسيمات الشحمية، 16 للفيروسات مثل الجزيئات 17،18 </سوب> والمواد البوليمرية المكروية (19). لسوء الحظ، العديد من هذه الطرق ما يعرقل انخفاض معدلات امتصاص الخلوية، 20،21 الاستقرار الفقراء، 22 غير مقصودة الخلية من نوع خصوصية، 23 خصائص الهروب منخفض endosomal 24 وسمية. 25 وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من البروتين تقنيات التنبيغ تقلل من النشاط الحيوي من البروتينات تسليمها. 14
لدينا مختبر أظهرت في وقت سابق ان نوكلياز الزنك الاصبع (ZFN) بروتينات – تقييد خيالية endonucleases تتألف من السيستئين 2 العاهل 2 الزنك والبروتين إصبع ملزم DNA للبرمجة والمجال انشقاق من FokI تقييد نوكلياز داخلية 26-28 – هم الخلوي بطبيعتها قابلة للاختراق. وقد أظهرت 29 هذا النشاط لاختراق الخلية من المستغرب أن تكون خاصية ذاتية للمجال الزنك إصبع مصمم خصيصا، منصة ملزم DNA التي برزت كأداة قوية لاستهداف الجينوم ENgineering، 30-32 والتي تعتبر نتيجة لكوكبة من ستة بقايا موجبة على سطح البروتين. في الواقع، وقد ثبت عدة البروتينات الحمض النووي ملزم، بما في ذلك ج يونيو وN-دك لامتلاك قدرة فطرية لعبور أغشية الخلايا. 33 وفي الآونة الأخيرة، توسع المختبر لدينا على هذه النتائج وأظهرت أن النشاط لاختراق الخلية من zinc- يمكن الاستدانة الإصبع (زيف) المجالات لداخل الخلايا تسليم البروتين. الانصهار الوراثي إما واحد أو بإصبعين المجالات زيف إلى البضائع البروتين محددة أدى إلى امتصاص الكفاءة التي تجاوزت العديد من أنظمة تسليم الببتيد اختراق الخلية التقليدية. 34 وأبرزها، زيف بوساطة تسليم لا تمس النشاط من البضائع الأنزيمية تنصهر وسهلت مستويات عالية من تسليم عصاري خلوي. بشكل جماعي، تؤكد هذه النتائج على إمكانات المجال زيف لتسهيل التنفيذ الفعال وسطحي من البروتينات، وأنواع يحتمل أن تكون أكثر تنوعا من ماكروالجزيئات، في الخلايا.
هنا، يتم تقديم خطوة بخطوة بروتوكول مفصلة حول كيفية تنفيذ تكنولوجيا زيف للتسليم البروتين في خلايا الثدييات. نحن شيدت من قبل مجموعة من واحد، اثنان، ثلاثة، وأربعة، خمس وستة أصابع المجالات زيف التي تفتقر إلى القدرة على ربط الحمض النووي، ويرجع ذلك إلى استبدال كل من المخلفات ملزم DNA-α حلزونية، ولكن هي قادرة على تقديم البروتينات في خلايا 34 (الشكل 1). يوصف إنتاج وتنبيغ الزمرد GFP (EmGFP) في خلايا هيلا باستخدام بإصبعين زيف المجال. هذا البروتوكول هو للمد إلى ما يقرب من أي بروتين قادر على التعبير القابلة للذوبان في القولونية وأي نوع من الخلايا الثدييات تقريبا. وتقدم النتائج المتوقعة وتناقش أيضا استراتيجيات لتحقيق أقصى قدر من الأداء لهذا النظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتسليم البروتين باستخدام الزنك الاصبع (زيف) نطاقات خلية قابلة للاختراق. المجال زيف لا يقلل من نشاط تنصهر البضائع الأنزيمية 34؛ يسمح لإنتاج وتنقية البروتينات في عائدات متطابقة تقريبا لتلك التي لوحظت مع البروتين معدلة. ويمكن نق?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DP1CA174426 لكارلوس F. BARBAS) وجامعة ShanghaiTech، شنغهاي، الصين (لJL). تم إنشاؤها باستخدام الرسومات الجزيئية PyMol.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
Referencias
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O’Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r, S., Banta, An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genética. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F., Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
