세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub> 2</sub> - 그의<sub> 2</sub> 아연 손가락 도메인
Summary
징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
고효율 및 다양한 단백질 전달 전략은 많은 기초 연구 및 치료 응용 프로그램에 대한 중요합니다. 세포에 정제 된 단백질의 직접 배달이를 달성하기위한 가장 안전하고 가장 쉬운 방법 중 하나. 1, 2 핵산에서 유전자 발현에 의존하는 전략을 달리 표현, 3-5 단백질 배달에서 삽입 돌연변이 유발의 위험을 제기하지 무관 세포의 전사 / 번역 기계 및 즉각적인 효과를 할 수 있습니다. 그러나 단백질에 세포 침투 활동을 부여하는 대한 단순하고 일반화 방법의 부족은 정기적으로 세포에 직접적인 항목을 혼동. 단백질의 세포 내 전달을 용이하게하기위한 현재의 방법은 천연 또는 6-8 설계된 세포 침투 펩타이드 9-12 과급 전달 도메인, 13, 14 및 15 나노 리포좀 16 바이러스 입자 17,18 발생의 사용에 기초 </SUP>과 고분자 미세 물질. (19) 불행하게도, 이러한 방법의 대부분이 낮은 세포 흡수 속도, 20, 21 가난한 안정성, (22) 실수로 세포 형 특이도, 23 낮은 엔도 좀 탈출 등록 (24)과 또한 독성. (25)에 의해 방해된다, 많은 단백질 전달 기술은 전달 단백질의 생체 활성을 감소시킨다. (14)
우리 연구소는 이전에 아연 손가락 핵산 분해 효소를 증명 (ZFN) 단백질 – 키메라 제한이 프로그램의 Cys 2 – 그의 두 아연 손가락 DNA 결합 단백질과 FokI 제한 엔도 뉴 클레아 제 26 ~ 28의 절단 도메인으로 구성된 엔도 뉴 클레아 제 – 본질적으로 세포 – 아르 투과. (29)이 놀라운 세포 침투 활동은 맞춤 디자인 아연 손가락 도메인, 대상 게놈 엉위한 강력한 도구로 떠오르고있다 DNA 결합 플랫폼의 고유 재산 것으로 나타났다공학에, 30-32 간주은 단백질 표면에 양전하 여섯 잔기의 콘 스텔 레이션의 결과 일 수있다. 실제로, C 6 월 및 N-DEK 비롯한 여러 DNA 결합 단백질이. 세포막을 건너 타고난 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다 (33)은보다 최근에, 본 연구실은 이러한 결과를 확장하고 입증하는 아연의 셀 관통 활동 손가락 (ZIF) 도메인은 세포 내 단백질 전달을 위해 활용 될 수있다. 많은 기존의 세포 침투 펩타이드 전달 시스템을 초과 효율성을 빨아들이는 관 주도 특정 단백질화물에 1 또는 2 손가락 ZIF 도메인 중 하나의 유전자 융합. (34) 가장 주목할만한, ZIF 매개 배달 융합 효소화물의 활동을 손상시키고 용이하지 않았다 세포질 전달의 높은 수준. 종합적으로, 이러한 결과는 단백질의 효율적이고 용이 한 전달을 용이하게하기 위해 도메인의 ZIF 가능성을 입증하고, 매크로 잠재적으로보다 다양한 종류의세포에 분자.
여기, 포유 동물 세포에서 단백질 전달을위한 ZIF 기술을 구현하는 방법에 대한 자세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 우리는 이전의 제품군을 구성 액형, 2 차원, 3 ~, 네살, 다섯 자리와 여섯 손가락 인해 α 나선 DNA 결합 잔류 각각의 대체 선수로, DNA를 결합하는 능력이 부족 ZIF 도메인 만 셀 (34) (도 1)로 단백질을 제공 할 수있다. 두 손가락 ZIF 도메인을 이용하여 HeLa 세포에 GFP 에메랄드 (EmGFP)의 제작 및 형질 도입에 대해서 설명한다. 이 프로토콜은 대장균에서의 발현 및 수용성 거의 모든 포유 동물 세포 유형 가능한 거의 모든 단백질로 확장 가능하다. 예상되는 결과가 제공되며,이 시스템의 성능을 최대화하기위한 전략도 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 세포 투과성 아연 손가락 (ZIF) 도메인을 사용하여 단백질 전달을위한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. ZIF 도메인 융합 효소화물 (34)의 활성을 감소시키지 않는다; 생산 및 수정되지 않은 단백질과 관찰 된 것과 거의 동일한 수익률 단백질의 정제 할 수 있습니다; 전통적인 세포 투과 펩티드 또는 단백질 전달체 시스템 효율성을 초과하여 세포 유형 내로 다양한 단백질 및 효소를 운반…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은과 ShanghaiTech 대학, 상하이, 중국 (DP1CA174426 카를로스 F. 바스 (Barbas)로) (JL에) 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 분자 그래픽 파이 몰을 이용하여 생성 하였다.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
Referencias
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