תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
מאוד אסטרטגיות אספקת החלבון יעילה ותכליתיות הן קריטיות למחקר בסיסי ויישומים רבים טיפוליים. המשלוח הישיר של חלבונים מטוהרים לתאים מייצג את אחד מהשיטות הבטוחות ביותר והקלה ביותר להשגת מטרה זו. בניגוד ל1,2 אסטרטגיות המסתמכות על ביטוי גנים מחומצות גרעין, 3-5 משלוח החלבון אינו מהווה סיכון של mutagenesis insertional, אינו תלוי ב שעתוק / מכונות תרגום וסלולרי מאפשר לתוקף באופן מיידי. עם זאת, חוסר שיטות פשוטות ולהכליל למעניקים פעילות חודרת תאים על חלבונים מבלבל באופן שגרתי הכניסה הישירה שלהם לתאים. שיטות קיימים להקלת משלוח חלבון תאית המבוססות על השימוש באופן טבעי 6-8 או תוכנן פפטידים חודרים-תא, 9-12 תחומים התמרה לעייף, ו13,14 חלקיקים 15 ויפוזומים, 16 חלקיקים כמו וירוס-17,18 </sup> וחומרים פולימריים microsphere. 19 למרבה הצער, רבים מן הגישות הללו הם הקשו על ידי שיעורים נמוכים סלולריים ספיגה, 20,21 יציבות עניה, 22 סגוליות שלא במתכוון תא מסוג, 23 נכסי בריחת endosomal הנמוך 24 ורעילות. 25 בנוסף, רב חלבון טכנולוגיות התמרה להפחית את הפעילות הביולוגית של החלבונים נמסרו. 14
המעבדה שלנו הראתה כי nuclease אבץ-אצבע בעבר חלבונים (ZFN) – הגבלת chimeric endonucleases בהיקף של 2 כלי- 2 חלבון לתכנות Cys אבץ-אצבע ה- DNA מחייבת ותחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI 26-28 – מטבעם תאי ד' חדיר. 29 פעילות חודרת תאים מפתיע זה הוצגה להיות רכוש מהותי של תחום אבץ-אצבע אישית מעוצב, פלטפורמת ה- DNA מחייב שהתפתחה ככלי רב עוצמה למטרת הגנום enההנדסה באמריקה, 30-32 ונחשבת לתוצאה של קבוצת הכוכבים של שש שאריות מטען חשמליות חיוביות על פני החלבון. ואכן, כמה חלבוני קושרי DNA, כוללים ג-ג'ון וN-DEK הוכחו יש יכולת מולדת לחצות קרום תא. 33 לאחרונה, המעבדה שלנו התרחבה על תוצאות אלו, והראו שהפעילות חודרת תאים של zinc- תחומים אצבע (ZIF) יכולים להיות ממונפים למסירת חלבון תאית. היתוך גנטי של שני תחומים זיף אחת או שתי אצבעות למטען חלבון מסוים הוביל לספיגה יעילה שעלו על מערכות רבות קונבנציונליות חודר תאי פפטיד משלוח. 34 בעיקר, משלוח בתיווך זיף לא התפשר הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו והקל רמות גבוהות של משלוח cytosolic. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה להדגים את הפוטנציאל של תחום הזיף להקלה על ההעברה היעילה וקלילה של חלבונים, וסוגים שעלולים להיות יותר מגוונים של מאקרומולקולות, לתאים.
כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט על כיצד ליישם טכנולוגית זיף למסירת חלבון בתאי יונקים מוצג. בנינו חבילה של עבר אחד, שתיים, שלוש, ארבעה, חמש ושש-אצבע תחומים זיף שחסר את היכולת לקשור DNA, עקב החלפה של כל אחד משאריות ה- DNA מחייבת α-סליל, אבל הם מסוגלים לספק חלבונים לתאים 34 (איור 1). הייצור והתמרה של Emerald GFP (EmGFP) לתאי הלה באמצעות תחום זיף שתי אצבעות מתוארת. פרוטוקול זה הוא הרחבה לכמעט כל חלבון מסוגל ביטוי מסיס בEscherichia coli וכמעט כל סוג של תאי יונקים. תוצאות צפויות מסופקות ואסטרטגיות למקסם את הביצועים של מערכת זו הם דנו גם.
כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד למסירת החלבון השתמשה בתחומי תא חדיר אבץ-אצבע (ZIF) מוצג. תחום הזיף אינו מפחית את הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו 34; מאפשר לייצור והטיהור של חלבונים בתשואות כמעט זהות לאלו שנצפו עם חלבון ללא שינוי; ויכול להעביר חלבונים ואנזימים למגוון ר…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (DP1CA174426 לקרלוס פ Barbas) ואוניברסיטת ShanghaiTech, שנחאי, סין (לJL). גרפיקה מולקולרית היו שנוצרה באמצעות PyMOL.
XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
SacI | New England Biolabs | R0156L | |
Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |