Прямая белка Доставка клетках млекопитающих, используя сотовый проницаемым Cys<sub> 2</sub> -Его<sub> 2</sub> Цинк пальцев Домены
Summary
Цинк-пальцев доменов по своей природе клеточных проницаемой и способны опосредовать доставку белка в широком диапазоне типов клеток млекопитающих. Здесь подробная шаг за шагом протокол для реализации технологии цинк-пальцем для внутриклеточной доставки белков представлена.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
Высокоэффективные и универсальные стратегии доставки белка имеют решающее значение для многих фундаментальных исследований и терапевтического применения. Прямые поставки очищенных белков в клетках является одним из самых безопасных и простых способов для достижения этой цели. 1,2 В отличие от стратегий, которые полагаются на экспрессию генов из нуклеиновых кислот, 3-5 поставка белок не представляет никакого риска инсерционного мутагенеза, не зависит от сотовая транскрипции / трансляции техника и позволяет для немедленного эффекта. Тем не менее, отсутствие простых и обобщению методов наделяя активности клеток проникающим на белки обычно смешивает их непосредственное вступление в клетках. Современные методы, способствующие внутриклеточной доставки белка основаны на использовании природного происхождения или 6-8-клеток, направленных проникающих пептидов, 9-12 наддувом трансдукции доменов, 13,14 наночастиц 15 и липосомы, 16 вирусоподобные частицы 17,18 </SUP> и полимерные микросфер материалы. 19 К сожалению, многие из этих подходов мешает низких сотовых ставок поглощения, 20,21 плохую стабильность, 22 случайного типа клеток специфичности, 23 низкая эндосомные свойств эвакуации 24 и токсичность. 25 Кроме того, многие белок трансдукции технологии уменьшить биологическую активность доставленного белков. 14
Наша лаборатория ранее показали, что цинк-пальцем нуклеазу (ZFn) белки – химерные эндонуклеаз рестрикции, состоящее из блока программируемого Cys 2 -Его 2 цинк-пальцев ДНК-связывающего белка и области расщепления рестриктазой Фоки 26-28 – по сути своей Cell- проницаемой. 29 Это удивительное клеток проникающим деятельность было показано, что внутреннее свойство специально разработанный области цинк-пальцев, ДНК-связывающий платформы, которая возникла в качестве мощного инструмента для целенаправленного геном ENинженерии, 30-32 и считается результатом созвездии шесть положительно заряженных остатков на поверхности белка. В самом деле, несколько ДНК-связывающих белков, в том числе с-июне и N-ДЭК, как было показано, обладают врожденной способностью пересекать клеточные мембраны. 33 Совсем недавно в нашей лаборатории расширен на этих результатах, и показано, что клетки-проникающей активность цинковых палец (ZIF) домены могут быть использованы для внутриклеточной доставки белков. Генетическая слияние либо одно- или двумя пальцами ZIF доменов в специфических белковых грузов привело к поглощению эффективности, превышающие многие традиционные системы доставки пептидных клеток проникающим. 34 В частности, ЗИФ-опосредованной доставки не поставить под угрозу деятельность плавленого ферментативной груза и способствовало высокие уровни цитозольного доставки. В совокупности эти данные показывают потенциал области ZIF для облегчения эффективного и легкое доставку белков, и, возможно, более разнообразные типы макроМолекулы, в клетки.
Здесь подробная шаг за шагом протокол о том, как реализовать ZIF технологии для доставки белка в клетках млекопитающих представлена. Ранее мы построили набор одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти- и шести пальцев ZIF домены, которые не обладают способностью связывать ДНК, в связи с заменой каждого из ДНК-связывающих остатков α-спиральные, но способных доставлять белки в клетках 34 (Рис 1). Производство и трансдукция Изумрудного GFP (EmGFP) в HeLa клеток, используя два пальца ZIF домен описано. Этот протокол является расширяемым почти любого белка, способного растворимого выражения в кишечной палочки и практически любой млекопитающих типа клеток. Ожидаемые результаты предоставляются и стратегии для максимизации производительности этой системы также обсуждается.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь шаг за шагом протокол для доставки белка с помощью мобильного проницаемым цинка палец (ZIF) домены представлена. Домен ЗиФ не снизить активность плавленого ферментативной груза 34; позволяет для производства и очистки белков урожайности почти идентичны тем, которые наблюдаю?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DP1CA174426 Карлоса Ф. Barbas) и ShanghaiTech университета, Шанхай, Китай (до JL). Молекулярные графика были получены с использованием PyMOL.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
Referencias
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O’Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r, S., Banta, An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genética. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F., Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
