Un modèle de souris pour induite par laser néovascularisation choroïdienne

Summary

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Abstract

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

La dégénérescence maculaire (AMD) liée à l'âge est l'un des principales causes de cécité chez les personnes âgées de plus de 50 ^1-3. AMD peut être classée en deux formes: atrophique ("sec") et AMD néovasculaire («humide») AMD. Le premier est caractérisé par une atrophie géographique de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), choriocapillaire et photorécepteurs, tandis que le second est caractérisé par l'invasion de vaisseaux anormaux de la choroïde dans les couches rétiniennes externes provoquer une fuite, une hémorragie, et la fibrose, et, finalement, conduisant à la cécité ^1,2. Parmi les deux formes, la DMLA néovasculaire représente la majorité de la perte de vision ^1. Heureusement, cette forme a de nombreuses options de gestion pharmacologiques efficaces, tandis que son homologue atrophique a actuellement pas prouvé traitements médicaux ^3. En outre, parce que la forme néovasculaire a été facilement ré-capitulé dans un modèle animal, il a été plus largement accessible à A baseRecherche MD explorer les mécanismes pathologiques sous-jacents afin de développer de nouvelles thérapies ^4.

Le premier modèle animal expérimental de la néovascularisation choroïdienne (NVC) est développé par Ryan et al. dans des primates non humains ^5. Ce modèle de rupture induite par la membrane de Bruch par photocoagulation au laser, ce qui a provoqué une réponse inflammatoire locale résultant dans l'angiogenèse similaire à celui observé dans la DMLA néovasculaire. La progression histopathologique de l'angiogenèse post-induction laser a été trouvé pour imiter la DMLA néovasculaire, qui a confirmé la validité du modèle ^6. Les primates non humains offrir l'anatomie la plus proche de l'homme, mais, malheureusement, sont coûteux à entretenir, ne peut pas être facilement manipulées génétiquement, et avoir un cours de temps lente progression de la maladie ^7. Par contraste, des modèles de rongeurs sont beaucoup plus rentable de maintenir, peuvent être manipulées génétiquement avec une relative facilité, et ont une beaucoup plus rapide course de progression de la maladie (les expériences peuvent être effectuées sur une échelle de temps de semaine contre mois). Ces expériences ne doivent être effectués chez les rongeurs pigmentées car il est très difficile de visualiser chez les animaux albinos.

Le modèle CNV souris induit par laser, d'abord développé par le groupe Campochiaro dans la fin des années 90 ^{à 10,} a grandi pour devenir le modèle animal dominant dans la majorité des études récentes ^11-16. En raison de la pathogénie complexe et encore peu claire de CNV, le modèle laser a été appliquée dans tous les aspects de la recherche DMLA humide allant de l'étude des mécanismes moléculaires de conduite angiogenèse à l'évaluation de nouvelles modalités thérapeutiques à usage humain avenir. Par exemple, Sakurai et al. et Espinosa-Heidmann et al. utilisé le modèle de laser pour étudier l'effet des macrophages sur le développement de la CNV en utilisant des souris transgéniques et des traitements pharmacologiques d'appauvrissement ^{15, 16.} Giani et al. et Hoerster et al. utilisé la tomographie par cohérence optique (OCT) à l'image de la CNV dans un effort pour caractériser la progression de la CNV et comparer les résultats histopathologiques aux résultats observés sur imagerie OCT ^12,17 induite par laser. Enfin, des études impliquant l'injection intravitréenne d'agents anti-angiogéniques ont été utilisés comme pré-requis pour les essais sur l'homme et ont été vital dans le développement de la première génération d'agents anti-VEGF utilisés dans la gestion de la DMLA néovasculaire aujourd'hui ^10,18,19.

Des modèles alternatifs pour expérimentale CNV utilisent des méthodes chirurgicales pour induire CNV. Cette procédure consiste à injecter les substances pro-angiogéniques (par exemple des vecteurs viraux recombinants surexprimant VEGF, injection sous-rétinien de cellules RPE et / ou des billes de polystyrène) pour imiter l'expression accrue de VEGF vu dans la DMLA néovasculaire, dans le but de provoquer l'angiogenèse ^8,20. Cependant, cette méthode donne une fréquence considérablement plus faible de la néovascularisation; ces études ont montré que dans CNVSouris C57 / BL6 se produit dans 31% des injections contre la ~ taux de réussite de 70% vu dans la méthode de la photocoagulation au laser dans la même souche de souris ^8,14. Pour ces raisons, et compte tenu des avantages de l'utilisation des rongeurs contre des primates non humains, le modèle de souris de CNV induite par laser est devenu le modèle animal de la norme pour la plupart CNV DMLA néovasculaire expériences d'étude ^8.

L'œil de la souris est un tissu délicat minuscule de travailler avec. Manœuvre de l'œil de visualiser la rétine est difficile et nécessite beaucoup de pratique jusqu'à ce que la maîtrise est atteint. Cette tâche est compliquée par le fait qu'il doit être appris avec la main dominante et non dominante. En outre, après les mouvements fins nécessaires pour visualiser la rétine ont été tirées, la coordination entre les deux mains et la pédale de commande de fonctionnement du laser sont importants. Dans cet article, nous avons cherché à distiller les défis de l'apprentissage de toutes les manipulations physiques impliqués dans la CNV proc induite par laseredure dans un guide qui aiderait les opérateurs à atteindre un succès rapide avec ce modèle.

Protocol

Tous les animaux sont traités en conformité avec le Guide de l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire édition 2013, l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research, et approuvée par l'animal institutionnel Entretien et utilisation Comité pour l'Université Northwestern. Remarque: La procédure suivante peut être fait entièrement avec un seul opérate…

Representative Results

La quantification des lésions de NVC peut être effectuée par l'analyse des choroïde plat monté à l'aide de coloration par immunofluorescence pour étiqueter les navires CNV. Les deux méthodes les plus fréquemment employées de préparation de tissu sont étiquetage FITC-dextran, fait par perfusion immédiatement avant le sacrifice animal, ou post-mortem immuno-coloration avec un marqueur des cellules endothéliales. Ces deux méthodes ont été décrites en détail précédemment 13,14,21; <st…

Discussion

Il ya plusieurs facteurs qui peuvent affecter la livraison de laser et le développement des lésions CNV résultante après succès laser induction. Ces facteurs doivent être contrôlés et normalisés afin d'avoir les résultats les plus fiables. Le plus pertinent de ces facteurs sont la sélection de la souris (génotype, âge et sexe), sélection anesthésie, et les paramètres de laser.

Le modèle de souris spécifique utilisé peut avoir un effet significatif sur le cours du déve…

Materials

532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 gauge insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis