레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델
Summary
Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.
Abstract
The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.
Introduction
연령 관련 황반변 성 (AMD)는 50 ~ 3 세 이상의 개인 실명의 주요 원인 중 하나입니다. AMD는 두 가지 형태로 분류 할 수있다 : 위축성 ( "건조") AMD와 신생 혈관 ( "습식") AMD. 전자는 후자의 누설, 출혈 및 섬유증을 유발하는 외부 망막 층으로 맥락막에서 비정상적인 혈관의 침윤을 특징으로하면서, 망막 색소 상피 (RPE), 맥락막 모세, 감광체의 지리적 위축을 특징으로하고, 궁극적 실명 1,2 선도. 2 가지 형태로, 혈관 신생 AMD는 시력 상실 (1)의 대부분을 차지한다. 그것의 위축 대응은 의학적 치료 (3)을 입증 반면 다행히,이 형태는 다수의 효과적인 약물 관리 옵션이 없습니다. 신생 혈관은 쉽게 형태의 동물 모델에서 다시 항복되었으므로 더욱이, 그것은 기본적 접근에 더 넓게왔다소설 요법 (4)를 개발하기 위해 기본 병리학 적 메커니즘을 탐구 MD의 연구.
실험 맥락막 신생 혈관의 첫 번째 동물 모델은 라이언 등의 알에 의해 개발되었다. 인간이 아닌 영장류 5. 신생 혈관 AMD에서 본 것과 유사한 결과 혈관 로컬 염증 반응을 야기 광응고술 통해 부르크 막 파열이 모델 유도. 혈관 신생 후 레이저 유도의 조직 병리학 적 진행은 모델의 유효성 6 확인 신생 혈관 AMD를 모방 밝혀졌다. 비 – 인간 영장류는 인간과 가장 유사한 해부학을 제공하지만, 불행하게도, 유전자를 쉽게 조작 할 수 없으며, 유지 보수가 비싸고, 질병 진행 7 느린 시간 경과가있다. 이에 대해서, 설치류 모델은 훨씬 더 비용 효율적인 유지하기 위해 유전자 상대적으로 쉽게 조작 될 수 있고, 빠른 COU 많지질병 진행의 RSE (실험 대 주 개월의 시간 스케일로 수행 될 수있다). 이 알비노 동물 시각화하는 것은 매우 어렵다 이러한 실험은 착색 설치류에서 수행되어야한다.
처음 후반 90의 10 Campochiaro 그룹에 의해 개발 된 마우스 레이저 유도 CNV 모델은, 최근의 연구 11-16의 대부분의 지배적 인 동물 모델로 성장하고있다. 인해 CNV의 복잡하고 여전히 불분명 병인에, 레이저 모델은 장래의 사용을 위해 인간의 새로운 치료 방법을 평가하는 혈관 구동 분자 메커니즘을 연구에서부터 습식 AMD 연구의 모든면에 적용되어왔다. 예를 들어, 사쿠라이 등. 및 노사-Heidmann 등. 트랜스 제닉 마우스와 약리 플리먼트 (15, 16)을 사용하여 CNV의 개발에 대한 대 식세포의 효과를 조사하기 위하여 레이저 모델을 사용했다. GIANI 외. 및 Hoerster 등. 이미지에 사용되는 광 간섭 단층 촬영 (OCT) 레이저 유도 맥락막 신생 혈관의 진행을 특성화하고 OCT 이미징 12,17에 본 연구 결과에 병리 조직 학적 소견을 비교하기위한 노력의 일환으로 맥락막 신생 혈관. 마지막으로, 항 – 혈관 신생 제의 유리체 강내 주입과 관련된 연구는 인간의 임상 시험을위한 전제 조건으로 사용하고 신생 혈관 AMD 오늘 10,18,19의 관리에 사용되는 항 VEGF 제 1 세대의 개발에 매우 중요했다되었다.
실험 CNV의 대체 모델은 맥락막 신생 혈관을 유도하는 수술 방법을 사용합니다. 이 절차는 친 혈관 생성 물질을 주입하는 것을 포함 (VEGF 과발현 예 재조합 바이러스 벡터를, RPE 세포 및 / 또는 폴리스티렌 비드의 망막 하 주사) 혈관 8,20를 일으킬 목적으로, 신생 혈관 AMD에서 본 증가 VEGF 발현을 모방. 그러나이 방법은 신생 혈관의 대폭 낮은 발생률을 산출; 이러한 연구에서 그 CNV 나타났다C57 / BL6 마우스는 마우스 8, 14의 동일한 변형률에서 레이저 광응고술 방법에서 본 ~ 70 %의 성공률에 비해 주사의 31 %에서 발생한다. 이러한 이유로, 비 – 인간 영장류 대 설치류를 사용하는 장점을 주어, 레이저 – 유도 된 CNV의 마우스 모델은 대부분의 신생 혈관 AMD 연구 실험 8 CNV의 표준 동물 모델이되었다.
마우스의 눈은 작업 할 소문자, 섬세한 조직이다. 망막을 시각화 할 수있는 눈의 기동은 어렵고 숙달이 달성 될 때까지 많은 연습을 필요로한다. 이 작업이 우세 및 비 우세 손으로 학습해야한다는 사실에 의해 복잡하게된다. 망막을 시각화하는 세밀한 움직임을 알게 된 후에 또, 양손 및 레이저를 동작 풋 페달 사이의 조정은 중요하다. 본 논문에서는 레이저 유도 CNV의 PROC에 포함 된 물리적 조작의 모든 학습의 도전을 증류 모색운영자는이 모델 빠른 성공을 달성하는 데 유용한 가이드에 edure.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 레이저 유도 한 후 레이저 배달 및 결과 맥락막 신생 혈관 병변의 개발에 영향을 미칠 수있는 여러 요인이있다. 이러한 요소에 대한 제어 및 가장 신뢰할 수있는 결과를 위해 표준화되어야한다. 이들 인자의 대부분은 마우스 적절한 선택 (유전자형, 연령, 성별), 마취제 선택, 레이저를 설정한다.
사용 된 특정 마우스 CNV 모델 개발 과정에 상당한 영향을 미칠 수있다….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.
Materials
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 gauge insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
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