Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea
Summary
Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.
Abstract
The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.
Introduction
Edad relacionados con la degeneración macular (AMD) es una de las principales causas de ceguera en personas mayores de 50 1.3. AMD se puede clasificar en dos formas: atrófica ("secar") y AMD neovascular ("húmeda") de AMD. El primero se caracteriza por la atrofia geográfica del epitelio pigmentario de la retina (RPE), coriocapilar, y los fotorreceptores, mientras que el último se caracteriza por la invasión de vasos anormales de la coroides en las capas externas de la retina causando fugas, hemorragia y fibrosis, y en última instancia que conduce a la ceguera 1,2. De las dos formas, AMD neovascular da cuenta de la mayoría de la pérdida de visión 1. Afortunadamente, esta forma tiene numerosas opciones de gestión farmacológicos eficaces, mientras que su contraparte atrófica Actualmente no ha probado los tratamientos médicos 3. Además, debido a la forma neovascular ha sido re-capitulado fácilmente en un modelo animal, ha sido más ampliamente accesible a A básicaInvestigación MD explorar los mecanismos patológicos subyacentes a fin de desarrollar nuevas terapias 4.
El primer modelo animal experimental de la neovascularización coroidea (CNV) fue desarrollado por Ryan et al. en primates no humanos 5. Esta ruptura modelo inducido de la membrana de Bruch a través de la fotocoagulación con láser, lo que provocó una respuesta inflamatoria local dando como resultado en la angiogénesis similar a la observada en neovascular AMD. Se encontró que la progresión histopatológico de la angiogénesis inducción post-láser para imitar la DMAE neovascular, que confirmó la validez del modelo de 6. Los primates no humanos ofrecer la anatomía más similares a los humanos, pero desafortunadamente, son caros de mantener, no puede ser manipulado fácilmente genéticamente, y tienen un curso lento tiempo de progresión de la enfermedad 7. En contraste, los modelos de roedores son mucho más rentable para mantener, pueden ser manipulados genéticamente con relativa facilidad, y tienen un mucho más rápido course de progresión de la enfermedad (experimentos pueden llevarse a cabo en una escala de tiempo de semana frente a meses). Estos experimentos solamente deben llevarse a cabo en roedores pigmentadas ya que es muy difícil de visualizar en animales albinos.
El modelo CNV inducida por láser del ratón, primero desarrollado por el grupo Campochiaro a finales del 90 de 10, se ha convertido en el modelo animal dominante en la mayoría de los estudios recientes 11-16. Debido a la patogénesis complejo y todavía no está claro de CNV, el modelo de láser se ha aplicado en todos los aspectos de la investigación AMD húmeda que van desde el estudio de los mecanismos moleculares de conducción de la angiogénesis para la evaluación de nuevas modalidades de tratamiento para el futuro uso humano. Por ejemplo, Sakurai et al. y Espinosa-Heidmann et al. utilizado el modelo de láser para investigar el efecto de los macrófagos en el desarrollo de la CNV utilizando ratones transgénicos y los tratamientos farmacológicos de agotamiento 15, 16. Giani et al. y Hoerster et al. usado tomografía óptica de coherencia-(OCT) para la imagen de la CNV en un esfuerzo por caracterizar la progresión de la CNV y comparar los resultados con los hallazgos histopatológicos observados en imágenes de OCT 12,17 inducida por láser. Finalmente, los estudios que implican la inyección intravítrea de agentes anti-angiogénicos se han utilizado como pre-requisitos para los ensayos en humanos y fueron vitales en el desarrollo de la primera generación de agentes anti-VEGF utilizadas en la gestión de AMD neovascular hoy 10,18,19.
Modelos alternativos para la CNV experimental utilizan métodos quirúrgicos para inducir la CNV. Este procedimiento implica la inyección de sustancias pro-angiogénicos (por ejemplo, vectores virales recombinantes que sobreexpresan VEGF, inyección subretiniana de células del EPR y / o perlas de poliestireno) para imitar el aumento de la expresión del VEGF se ve en neovascular AMD, con el objetivo de causar la angiogénesis 8,20. Sin embargo, este método produce una incidencia drásticamente inferior de la neovascularización; estos estudios mostraron que en la CNVRatones C57 / BL6 se produce en 31% de las inyecciones frente al ~ 70% de éxito visto en el método de la fotocoagulación con láser en la misma cepa de ratones 8,14. Por estas razones, y dadas las ventajas del uso de roedores en comparación con primates no humanos, el modelo de ratón de la CNV inducida por láser se ha convertido en el modelo animal estándar para la mayoría de CNV neovasculares experimentos de estudio de AMD 8.
El ojo es un ratón, delicado tejido minúsculo para trabajar. Maniobras del ojo para visualizar la retina es difícil y requiere mucha práctica hasta que se alcanza la maestría. Esta tarea se complica por el hecho de que debe ser aprendido con la mano dominante y no dominante. Por otra parte, después de que los finos movimientos necesarios para visualizar la retina se han aprendido, la coordinación entre ambas manos y el pedal de funcionamiento del láser son importantes. En este trabajo, hemos tratado de destilar los desafíos de aprender todas las manipulaciones físicas involucradas en la CNV proc inducida por láseredure en una guía que ayudará a los operadores a lograr un rápido éxito con este modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existen múltiples factores que pueden afectar la entrega de láser y la consiguiente desarrollo de la lesión NVC tras éxito láser inducción. Estos factores deben ser controlados por y estandarizados con el fin de tener los resultados más confiables. El más pertinente de estos factores son la selección del ratón (genotipo, edad y sexo), la selección de anestésico, y la configuración de láser.
El modelo específico de ratón utilizada puede tener un efecto significativo en el curs…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.
Materials
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 gauge insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
Referencias
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