Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

Summary

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Abstract

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

Età degenerazione maculare (AMD) è una delle principali cause di cecità negli individui di età superiore ai 50 ^1-3. AMD possono essere classificati in due forme: atrofica ("a secco") e AMD neovascolare ("wet") di AMD. La prima è caratterizzata da atrofia geografica dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), coriocapillare e fotorecettori, mentre il secondo è caratterizzato dalla invasione dei vasi anomali della coroide negli strati retinici esterni causando perdite, emorragia, e la fibrosi, e in ultima analisi, porta alla cecità ^1,2. Delle due forme, AMD neovascolare rappresenta la maggior parte della perdita della vista ^1. Fortunatamente, questa forma ha numerose opzioni efficaci per la gestione farmacologica, mentre la sua controparte atrofica attualmente con dimostrato trattamenti medici ^3. Inoltre, perché la forma neovascolare è stato facilmente ri-capitolò in un modello animale, è stato più ampiamente accessibili a un baseRicerca MD esplorare i meccanismi patologici alla base per lo sviluppo di nuove terapie ^4.

Il primo modello animale di neovascolarizzazione coroidale sperimentale (CNV) è stato sviluppato da Ryan et al. nei primati non umani ^5. Questo modello di rottura indotta della membrana di Bruch con la fotocoagulazione laser, che ha causato una risposta infiammatoria locale con conseguente angiogenesi simile a quello visto in AMD neovascolare. La progressione istopatologica dell'angiogenesi induzione post-laser è stato trovato per imitare AMD neovascolare, che ha confermato la validità del modello ^6. Primati non umani offrire l'anatomia più simili agli esseri umani, ma purtroppo, sono costosi da mantenere, non può essere facilmente manipolati geneticamente, e hanno un decorso lento della progressione della malattia ^7. Contrastingly, modelli di roditori sono molto più costo-efficace per mantenere, può essere geneticamente manipolati con relativa facilità, e hanno un molto più veloce course di progressione della malattia (esperimenti possono essere condotti su una scala temporale di settimane rispetto a mesi). Questi esperimenti dovrebbero essere condotti solo in roditori pigmentati in quanto è molto difficile da visualizzare in animali albini.

Il modello di CNV mouse laser-indotta, sviluppato dal gruppo di Campochiaro alla fine degli anni 90 del ^10, è cresciuto fino a essere il modello animale dominante nella maggior parte dei recenti studi ^11-16. A causa della patogenesi complessa e ancora chiaro di CNV, il modello laser è stato applicato in tutti gli aspetti della ricerca AMD umida che vanno dallo studio dei meccanismi molecolari dell'angiogenesi guida per valutare nuove modalità di trattamento per il futuro uso umano. Ad esempio, Sakurai et al. e-Espinosa Heidmann et al. utilizzato il modello laser per studiare l'effetto di macrofagi sullo sviluppo di CNV utilizzando topi transgenici e trattamenti farmacologici deplezione ^{15, 16.} Giani et al. e Hoerster et al. usato ottica tomografia a coerenza (OCT) per l'immagine del CNV, nel tentativo di caratterizzare la progressione della CNV e confrontare i risultati istopatologici i risultati visti in ottobre di imaging ^12,17 indotta da laser. Infine, gli studi che coinvolgono iniezione intravitreale di agenti anti-angiogenici sono stati usati come prerequisiti per la sperimentazione umana e sono stati di vitale importanza nello sviluppo della prima generazione di agenti anti-VEGF utilizzate nella gestione di DMLE neovascolare oggi ^10,18,19.

Modelli per CNV sperimentale alternativi utilizzano metodi chirurgici per indurre CNV. Questa procedura comporta l'iniezione di sostanze pro-angiogenici (ad esempio vettori virali ricombinanti overexpressing VEGF, iniezione sottoretinica di cellule RPE e / o perline di polistirene) per imitare l'aumentata espressione di VEGF visto in DMLE neovascolare, con l'obiettivo di causare angiogenesi ^8,20. Tuttavia, questo metodo si ottiene un drasticamente minore incidenza di neovascolarizzazione; questi studi hanno dimostrato che in CNVC57 / BL6 topi si verifica nel 31% delle iniezioni rispetto al tasso di successo ~ 70% visto nel metodo fotocoagulazione laser nello stesso ceppo di topi ^8,14. Per queste ragioni, e dati i vantaggi dell'utilizzo di roditori rispetto a primati non umani, il modello murino di indotta da laser CNV è diventato il modello animale standard CNV per la maggior parte neovascolare esperimenti di studio AMD ^8.

L'occhio mouse è un minuscolo, delicato dei tessuti con cui lavorare. Manovre dell'occhio per visualizzare la retina è difficile e richiede molta pratica fino a raggiungere la padronanza. Questo compito è complicato dal fatto che deve essere appreso con la mano dominante e non dominante. Inoltre, dopo che i movimenti fini richieste per visualizzare la retina sono stati tratti, il coordinamento tra entrambe le mani e il pedale funzionamento del laser sono importanti. In questo lavoro, abbiamo cercato di distillare le sfide di apprendimento di tutte le manipolazioni fisiche coinvolte nel indotta da laser CNV procedure in una guida che avrebbe aiutato gli operatori a raggiungere un rapido successo con questo modello.

Protocol

Tutti gli animali sono trattati in conformità con la guida della cura e l'uso di animali da laboratorio 2013 Edition, l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e approvato dal Animal Istituzionale Cura e Comitato Usa per la Northwestern University. Nota: La seguente procedura può essere eseguita interamente con un operatore; tuttavia, è molto più efficiente condotto con due operatori ai…

Representative Results

Quantificazione del CNV può essere effettuata attraverso l'analisi dei coroide piatto montato con immunofluorescenza per etichettare i vasi CNV. I due metodi più frequentemente utilizzati di preparazione dei tessuti sono etichettatura FITC-destrano, fatto tramite perfusione immediatamente prima del sacrificio degli animali, o post mortem immuno-colorazione con un marker delle cellule endoteliali. Entrambi questi metodi sono stati descritti in precedenza in dettaglio 13,14,21; figure</str…

Discussion

Ci sono diversi fattori che possono influenzare la consegna del laser e conseguente sviluppo CNV dopo il successo del laser-induzione. Questi fattori devono essere controllati e standardizzati per avere i risultati più affidabili. Il più pertinente di questi fattori sono la selezione del mouse (genotipo, età e sesso), la selezione anestetico, e le impostazioni di laser.

Il modello di topo specifico utilizzato può avere un effetto significativo sul corso dello sviluppo CNV. Il genotipo pi…

Materials

532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 gauge insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis