הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Summary

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7_TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Abstract

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.

Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7_CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7_TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

Introduction

הגורם המוביל לתמותה מסרטן השד הוא באמצעות גרורות ^{1, 2.} Taxanes, כגון docetaxel ו- paclitaxel, משמש כיום כקו ראשון משטר לטיפול בסרטן השד גרורתי ^{2, 3, 4, 5, 6.} הם חלק מהקבוצה של סוכני מיקוד-microtubule (MTAs) משבשי דינמיקת microtubule. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר באמצעות taxanes בטיפול מרפא הוא הפיתוח של התנגדות taxane בתאים סרטניים, אשר מובילה למחלות ישנות ^7. עמידות לתרופות אחראית ליותר מ -90% מכלל מקרי המוות בקרב חולי סרטן שד גרורתי ^7.

Microtubules נוצרות על ידי פילמור של heterodimers α- ו β טובוליןclass = "Xref"> ^{8, 9.} ההתקנה המדויקת של דינמיקת microtubule חשובה תפקודים תאיים רבים, כולל קיטוב תא, התקדמות מחזור התא, תחבורה תאית, ואיתות תא. חוסר וויסות של microtubules והדינמיקה שלהם ישבש תפקוד התא לגרום מוות של תאים ^{10, 11.} תלוי איך הם לגרום חוסר וויסות זה, תרופות MTA ניתן לסווג גם כסוכני ייצוב microtubule (כלומר, taxanes) או סוכני microtubule-destabalizing (כלומר, אלקלואידים וינקה או באתר קולכיצין סוכנים מחייב) ^20. למרות ההשפעות שלהם הפוכות על מונית microtubule, במינון מספיק, כיתות שניהם יכולות להרוג תאים סרטניים באמצעות השפיע על דינמיקת microtubule ^21.

Taxanes לתפקד בעיקר על ידי ייצוב microtubule ציר ^12, המובילחוסר תיאום כרומוזומליות. ההפעלה התמידית הבאה של מחסום הרכבת ציר (SAC), עוצרת את תא מיטוזה. מעצר mitotic ממושך ואז גורם לאפופטוזיס ^{13, 14.} Taxane אינטראקציה עם microtubules דרך האתר taxane מחייב על β טובולין ^{8, 15,} אשר שוהה רק טובולין התאספו ^16.

מנגנונים מרובים להתנגדות taxane הוצעו ^{9, 17.} מנגנונים אלה כוללים הן התנגדות multidrug כללית בשל ביטוי יתר של חלבונים-בזרימת סמים taxane ספציפי התנגדות ^{5, 9, 18, 19.} לדוגמא, תאים סרטניים עמיד taxane יש בו כדי לשנות ביטוי ותפקוד של β-גיגית מסוימתulin isotypes ^{5, 9, 19, 20, 21, 22, 23.} באמצעות שיטה in vivo למדוד חוסר יציבות microtubule דינמי, אנו מראים כי, כאשר בהשוואה ללא-עמיד, תאי _CC MCF-7 הוריה ^17, דינמיקת microtubule של תאי docetaxel העמיד MCF-7 _TXT הן רגישה לטיפול docetaxel.

כדי להבין טוב יותר את הפונקציה של MTAs ואת המנגנון המדויק של התנגדות taxane בתאים סרטניים, זה הכרחי למדוד דינמיקת microtubule. כאן אנו מדווחים שיטה in vivo לעשות זאת. באמצעות הדמיה חיה בשילוב עם ביטוי של טובולין-tagged GFP בתאים, אנו יכולים למדוד את הדינמיקה microtubule של _TXT MCF-7 ותאי _CC MCF-7 עם ואינטרנטthout טיפול docetaxel. התוצאות יכולות לעזור לנו לעצב תרופות יעילות יותר שיכול להתגבר על התנגדות taxane.

Protocol

1. הכנת תאים עבור הדמיה חיה תרבות זריעת תאים השתמש תאי סרטן השד MCF-7 נבחרו להתנגדות docetaxel (MCF-7 TXT) וקו תא ההורים שאינם העמיד שלהם (CC MCF-7). תהליך הבחירה מפ?…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המובא כאן, חקרנו את ההשפעות של docetaxel על הדינמיקה microtubule של הנורמה (CC MCF-7) ו- docetaxel עמיד (MCF-7 TXT) תאי סרטן השד. שני סטים של תמונות להראות את ההשפעות של docetaxel (0.5 מיקרומטר) על צמיחה microtubule וקיצור ב CC MCF-7 ו MCF-7 תאים TXT <strong…

Discussion

ישנן שתי שיטות עיקריות למדידת חוסר יציבות microtubule דינמי: במבחנה in vivo. בשיטה במבחנה, טובולין מטוהר משמש למדידת חוסר יציבות microtubule דינמית עם מיקרוסקופיה מחשב משופר זמן לשגות הפרש התערבות ניגודיות. בשיטת in vivo, microinjected טובולין ניאון, או הביע GFP-טובולין, ה?…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Non-essential amino acids	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenol red-free	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-well culture plate	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, Distributed by VWR	Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172