Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için
Summary
In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Abstract
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
Introduction
Meme kanseri ölümlerinin önde gelen nedenidir metastazı 1, 2 geçer. Birinci basamak metastatik meme kanseri, 2, 3, 4, 5, 6 tedavisinde rejimleri gibi dosetaksel ve paklitaksel gibi taksanlarm kendilerine hidrofobik şu anda kullanılmaktadır. Onlar mikrotübül dinamiklerini bozabilir mikrotübül hedefleme ajanları (MTAs) bir grubun parçasıdır. Ancak, küratif tedavi taksan kullanarak en büyük sorunlardan biri nüks 7 neden kanser hücrelerinde taksan direnci, geliştirilmesidir. İlaç direnci metastatik meme kanseri 7 olan hastalarda, tüm ölümlerin% 90'dan fazla sorumludur.
Mikrotübüller α- ve β-tübülin heterodimerlerinin polimerizasyonuyla oluşurclass = "xref"> 8, 9. mikrotubul dinamiği kesin düzenlemesi, hücre polarizasyon, hücre döngüsü ilerlemesinin, hücre içi ulaşım ve hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere birçok hücre fonksiyonları için önemlidir. Mikrotübüllerin ve dinamikleri bozulması hücre fonksiyonunu bozabilir ve hücre ölümü 10, 11 neden olur. Bu sistem bozukluğu neden bağlı olarak, MTA ilaçlar mikrotübül stabilize edici ajanlar (örneğin, taksanlar) ya da mikrotübül destabalizing maddeler (örneğin, vinka alkaloidler ve kolşisin yerinde bağlama maddeleri), 20, ya da sınıflandırılabilir. Mikrotübül kütlesi üzerindeki zıt etkilerine rağmen, yeterli dozda, hem sınıflar mikrotübül dinamiklerine 21 üzerindeki etkileri yoluyla kanser hücrelerini öldürür.
Taksan yol açan mikrotübül mili 12 dengeleyici öncelikle işlevkromozomal hiza. mili montaj kontrol noktasında (SAC) sonraki sürekli aktivasyon mitoz hücreyi tutuklamalar. Uzamış mitotik tutuklama daha sonra apoptoz 13, 14 olur. Taksan monte tubulin 16 sadece mevcut olan β-tubulin 8, 15, ilgili taksan bağlanma sitesi üzerinden mikrotübüller ile etkileşime girer.
Taksan direnç çok mekanizma 17 9 önerilmiştir. Bu mekanizmalar sayesinde ilaç akış proteinler ve taksan özgü direnci 5, 9, 18, 19 aşın hem genel hem de çoklu ilaç direncini kapsamaktadır. Örneğin, taksan dirençli kanser hücreleri, bazı β-küvet ekspresyonu ve fonksiyonunu değiştirmiş olabilirUlin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 izotipleri. Mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için bir in vivo yöntem kullanarak, dirençli olmayan ebeveyn MCF-7 hücreleri CC 17 ile karşılaştırıldığında, dosetaksel dayanıklı MCF-7 TXT hücrelerin mikrotübül dinamiklerinin dosetaksel tedaviye duyarlı olduğunu göstermektedir.
Daha iyi MTAs işlevini ve kanserli hücrelerde taksan direnci tam mekanizmasını anlamak için, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için esastır. Burada, bu sayede, bir in vivo yöntem sunulmaktadır. Hücrelerinde GFP-etiketli tubulin sentezlenmesi ile birlikte canlı görüntüleme kullanarak, MCF-7 TXT ve MCF-7 hücreleri CC ve wi mikrotübül dinamiklerinin ölçebilirthout dosetaksel tedavisi. Sonuçlar bize taksan direncini aşmak için daha etkili ilaçlar tasarlamaya yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro ve in vivo: mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için iki ana yöntem vardır. In vitro yöntemde, saflaştırılmış tubulin bilgisayar destekli zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile mikrotübül dinamik istikrarsızlık ölçmek için kullanılır. In vivo metodunda, floresan tubulin mikroenjeksiyon ya da GFP-tubulin ifade mikrotübüllere dahil edilir. Mikrotübül dinamikleri (büyüme ve kısalma) sonra fazlar arası hücrelerinin …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
Referencias
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
