라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는
Summary
In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Abstract
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
Introduction
유방암 사망률의 주요 원인은 전이 (1, 2)을 통해서이다. 첫번째 줄은 전이성 유방암 2, 3, 4, 5, 6의 치료식이 요법 등 도세탁셀과 같은 탁산 파클리탁셀은 현재 사용되고있다. 그들은 미세 소관 역학을 방해 미세 소관 타겟팅 에이전트 (MTA)의 그룹의 일부입니다. 그러나, 치료 요법 탁산을 사용하는 가장 큰 과제 중 하나는 재발 7 리드 암세포 탁산 저항의 개발이다. 약물 내성은 전이성 유방암 환자 중 7 모든 사망의 90 % 이상을 차지한다.
미세 소관은 α-와 β-tubulin에 이종의 중합에 의해 형성된다클래스 = "외부 참조"> 8, 9. 미소 관 역학의 정확한 조절은 세포 편광 세포주기 진행, 세포 이동, 및 세포 신호 전달을 포함한 많은 세포 기능에 중요하다. 미세 소관과 역학의 조절 곤란은 세포의 기능을 방해하고 세포 사멸 (10), (11)가 발생합니다. 그들은이 조절 곤란의 원인이 방법에 따라 MTA 약은 미세 소관 안정 화제 (즉, 탁산) 또는 미세 소관 – destabalizing 에이전트 (즉, 빈카 알칼로이드 또는 콜히친 현장 결합제) (20)로 분류 할 수있다. 미세 소관 질량에 대한 자신의 반대 효과에도 불구하고, 충분한 용량으로, 두 클래스는 미세 소관 역학 (21)에 미치는 영향을 통해 암 세포를 죽일 수 있습니다.
탁산은 선도, 미세 소관 스핀들 (12)을 안정화 주로 기능염색체 어긋남. 스핀들 어셈블리 검사 (SAC)의 후속 활성화는 영구 분열 셀을 체포. 장기간 유사 분열 체포는 세포 사멸 (13), (14)가 발생합니다. 탁 조립 튜 불린 (16) 만 존재하는 β-tubulin의 8, 15,에 탁산 바인딩 사이트를 통해 미세 소관과 상호 작용합니다.
탁산 저항 복합 메커니즘은, 17 (9)이 제안되어있다. 이러한 메커니즘으로 인해 약물 유출 단백질과 탁산 별 저항 5, 9, 18, 19의 과발현에 모두 일반적으로 다제 내성을 포함한다. 예를 들어 탁산 내성 암세포는 특정 β-욕조의 발현과 기능을 변경할 수도ulin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 이소 타입. 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 생체 내 방법을 사용함으로써, 우리는 무저항 부모 MCF-7 CC 셀 (17)에 비해, 도세탁셀 내성 MCF-7 TXT 세포의 미소 관 역학 도세탁셀 처리 둔감 보여준다.
MTA를 더의 기능과 암세포의 탁산 저항의 정확한 메커니즘을 이해하기 위해, 미세 소관의 동역학을 측정하는 것이 필수적이다. 여기, 우리는 그렇게하는 생체 내 방법을보고합니다. 세포에서 GFP 태깅 튜 불린의 발현과 결합 라이브 영상을 사용함으로써, 우리는 MCF-7 TXT 및 MCF-7 세포 CC 및 Wi 미세 소관의 동역학을 측정사전 통 보없이 도세탁셀 치료. 결과는 우리가 탁산 저항을 극복 할 수있는보다 효과적인 약물을 설계 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 외 및 생체 내에서 : 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외 방법에서는, 정제는 튜 불린 컴퓨터 향상된 경과 미분 간섭 현미경과 달리 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 데 사용된다. 생체 내 방법에있어서, 형광 튜 불린를 미세 주입 또는 GFP – 튜 불린을 표현, 미세 소관에 포함된다. 미세 소관의 동역학 (성장과 단축)가 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
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