JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

Published: June 28, 2018
doi:
10.3791/56650
, ,
1Department of Pathology,Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology,Yale University School of Medicine

Summary

事前の負傷で気道をコンディショニングすることでマウスの肺に肺癌細胞の同所性同種移植を大幅に強化する手法について述べる。このアプローチは肺微小環境、転移播種、肺癌併存、間質相互作用の研究にも適用可能性があり、派生した異種移植片をより効率的に患者を生成します。

Abstract

肺がんは、異種生物である致命的な治療難治性の疾患です。理解し胸部悪性腫瘍の完全な臨床スペクトルを効果的に治療するには、多様な人間の肺の癌のサブタイプとステージを要約することができます追加の動物モデルが必要です。同種または異種移植モデルは多目的、発癌性容量の生体内で、マウスやひと由来の悪性細胞を用いた定量化を有効にします。ただし、マウス細胞の肺への同所性同種移植の非効率性のためのフランクなどの非生理的サイトで肺のがん細胞の生着の上記の方法を行った。本研究ではあらかじめ線維症誘導エージェント ブレオマイシンとマウスの気道をコンディショニングすることで同所性同種肺がん細胞生着を強化する方法をについて説明します。概念実証実験としてマウスの系統にマウスまたは人的情報源から得られた肺腺癌のサブタイプの腫瘍細胞を接がへのこのアプローチを適用されます。我々 は腫瘍細胞の注入前にブレオマイシンと気道が負傷 0-17 から腫瘍細胞の生着が増加を示す 71 100%。大幅にこのメソッドが強化されたは、肺腫瘍の発生率と異なるモデルとマウス系統を使用して後続の副産物。さらに、明らかな移植肺癌細胞を関連する遠隔臓器に肺から発信します。したがって、我々 はの確立し、肺癌の細胞またはラットの量を制限することの新しい直交異方性モデルを維持し、肺癌細胞生理学的に関連する設定での発癌性の能力を定量的に評価するために使用できるプロトコルを提供します。.

Introduction

肺癌は主要ながんの原因関連死亡世界中1。肺癌患者は転移から最終的に屈する遠い器官、特に中枢神経系、肝臓、副腎、骨2,3,4。胸部の悪性腫瘍は、伝統的に小細胞肺癌 (SCLC) または非小細胞肺癌 (NSCLC) がん5として分類されています。非小細胞肺癌は、最も頻繁に悪性腫瘍の診断、肺腺癌 (LUAD) 肺扁平上皮癌 (LUSC)6など、さまざまな組織学的サブタイプに分割することができます。切除人間原発性肺癌のゲノム解析は、指定された histotype 内腫瘍では多様な分子の摂動、さらに彼らの発散の臨床進行に貢献し、患者の予後を交絡を表すことも明らかにしました。肺癌の顕著な不均一性は、合理的な設計、前臨床テスト、および効果的な治療戦略の実装に重要な挑戦を表します。その結果、多様な携帯電話の起源、分子サブタイプ、およびこの病気の段階を検討する難治性肺癌モデルのレパートリーを拡大する必要性があります。

モデル動物を用いた様々 なアプローチは肺癌生体内で、それぞれ独自の長所と短所の興味の生物的質問によって研究に採用されています。遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は腫瘍免疫ホスト7その中その結果特定の前駆細胞の種類に特定の遺伝子変異をターゲットできます。臨床的に関連する、非常に強力な GEMMs に関連付けられている待機時間、変動、および/または肺の腫瘍罹患率が特定の定量的計測と遠隔臓器8後期段階転移の検出に法外なことができます。補完的なアプローチという肺癌細胞、マウス腫瘍から直接を取得もしくは派生文化では、確立されたセルラインとして最初は同系のホストに再導入された同種移植モデルの使用であります。同様に肺癌異種移植片は、ひと細胞または患者の派生腫瘍サンプルから確立されます。ひと細胞ライン異種移植片または患者派生異種移植片 (PDXs) 免疫不全マウスにおける一般的に維持され、したがって完全な免疫監視9を排除します。この欠点にもかかわらず、人間 biospecimens 研究基礎的体内プロパティ GEMM 腫瘍よりもより複雑なゲノム異常のためエンコードひと癌細胞の量を制限することを伝達する道を提供します。

同種および異種移植片の 1 つの便利なプロパティは、がん幹細胞 (TICs) 悪性細胞人口10以内の頻度を定量化する採用、制限する従来の細胞希釈アッセイに従うことです。これらの実験で定義されたセル数は動物の側腹部に皮下し、チックの頻度は腫瘍を取る率に基づいて推定できます。皮下腫瘍しかしより低酸素11でき肺腫瘍微小環境のキーの生理学的な制約はモデル化されないことがあります。マウスの肺に上皮幹・前駆細胞気管内配信は、肺と気道幹細胞生物学12を勉強する方法です。ただし、肺が損傷、ウイルス感染13,14などの生理学的なフォームを受ける最初でない限りこの手法から生着率は比較的低いできます。炎症性間質細胞からのサポートおよび/または肺基底膜の中断は、遠位気道15に関連する幹細胞ニッチに移植細胞の保持を向上させる可能性があります。誘導剤の線維化がすることができます誘導多能性細胞16および17間葉系幹細胞の生着を強化する肺を事前条件も。気道損傷のようなフォームが生着率を適用できるかどうか、腫瘍開始容量と肺癌細胞の伸長がまだ体系的に評価します。

本研究では事前の負傷でマウスの肺をコンディショニングすることで同所性同種肺がん細胞生着の効率を上げる方法をについて説明します。LUAD にこれらの癌は、しばしば予後不良19と相関線維性間質18の開発の重要なサブセットと遠位気道で発生します。自然リボソーム ハイブリッド ペプチド-ポリケチド、ブレオマイシンはマウス20肺線維化を誘導するために広く利用されています。ブレオマイシンの気道注入は最初上皮消耗戦肺胞の炎症細胞、マクロファージ、好中球と単球21の募集を推進しています。遠位気道基底膜再編成22,23細胞外マトリックス (ECM) 蒸着24組織の改造現象が続きます。ほとんどの研究25で 30 日後に解決する線維症単一ブレオマイシン投与の効果は一時的なもの。同種および異種移植腫瘍モデルを用いた場合 LUAD 肺細胞の取る速度が大きく向上できるプレコンディショニング ブレオマイシンとマウスの気道をテストしました。

Protocol

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) イェール大学によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。 1. セットアップ/試薬の準備。 ブレオマイシン注意: ベースの世界調和システム (GHS) の分類および化学、ブレオマイシンは GHS08 保健上の危険として分類されます。 化学のフードにブレオマイシンを準備します。滅菌リン酸緩…

Representative Results

LUAD マウスの肺に癌細胞移植の効率を高めるには、まず事前条件を同所性同種腫瘍細胞の注入 (図 1) に続いてブレオマイシンを使用して航空プロトコルを開発しました。無胸腺を免疫不全マウスに投与した際にもブレオマイシンによる一時的な線維症気道アーキテクチャと増加のコラーゲン沈着 (図 2) の損失によって証明?…

Discussion

印象的な臨床の平行線は、肺癌と肺36の他の慢性疾患と記載されています。特に、特発性肺線維症 (IPF) 患者は、肺癌の増加好みを有しこの協会の歴史37,38を喫煙とは無関係です。IPF は、肺のアーキテクチャと ECM39の析出による呼吸機能の低下の進歩的な破壊によって特徴付けられます。また、外科的切除に続い?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立癌研究所 (R01CA166376 ・ D.X. ・ グエンに R01CA191489) と国防総省 (W81XWH-16-1-0227 D.X. グエンに) からの助成金によって賄われていた。

Materials

Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair – To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. –
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) –
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 –
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Tags

Lung CancerTumor-initiating CellsBleomycinOrthotopic EngraftmentPreclinical ModelFibrosisAirway Pre-conditioningCell TransplantationTracheal InjectionMouse Model

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image