Предварительного кондиционирования Airways мышей с блеомицин увеличивает эффективность приживления клеток рака легких ортотопическая
Summary
Мы описываем метод значительно повысить ортотопическая приживления клеток рака легкого в мышиных легкие путем предварительного кондиционирования airways с травмой. Этот подход может также применяться к исследованию стромальные взаимодействий внутри легких микроокружения, метастатические распространения, сопутствующие заболевания раком легких, и более эффективно создавать пациента производной ксенотрасплантатов.
Abstract
Рак легких является смертельной лечения огнеупорных болезнь, которая является биологически гетерогенной. Чтобы понять и эффективно лечить полный Клинический спектр грудной клетки злокачественных опухолей, необходимы дополнительные Животные модели, которые можно резюмировать подтипы рака различных человеческих легких и этапов. Аллотрансплантатом или гранулы ксенотрансплантата модели универсальны и дать количественную оценку онкогенной потенциала в естественных условиях, используя злокачественных клеток мышиных или человеческого происхождения. Однако ранее описанных методов приживления клеток рака легких выполнены в не физиологические сайтов, таких как фланг мышей, из-за неэффективности ортотопическая трансплантации клеток в легкие. В этом исследовании мы описываем метод для повышения ортотопическая легких рак клеток приживления путем предварительного кондиционирования airways мышей с фиброзом блеомицин заставить агент. Как доказательство концепции эксперимент мы применяли такой подход привить опухолевых клеток подтипа аденокарциномы легкого, полученные из антропогенных источников, или мыши в различных штаммов мышей. Мы демонстрируем, что ранив airways с блеомицин до инъекции клеток опухоли увеличивает приживления опухолевых клеток от 0-17% до 71-100%. Существенно этот метод расширения распространенности опухоли легких и последующие нарост, с использованием различных моделей и мыши штаммов. Кроме того раковые клетки прижившимися легких распространять из легких в соответствующих отдаленные органы. Таким образом мы предоставляем протокол, который может использоваться для создания и поддержания новых моделей ортотопическая рака легких с ограничением количества клеток или биопрепаратов и количественно оценить онкогенной способность клеток рака легкого в физиологически соответствующие параметры .
Introduction
Рак легких является ведущей причиной рака связанных смертей во всем мире1. У пациентов с раком легких в конечном итоге уступить от метастазов в отдаленные органы, в частности для центральной нервной системы, печени, надпочечники и кости2,3,4. Грудной клетки злокачественных опухолей традиционно были классифицированы как мелкоклеточный рак легких (МРЛ) или легких немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ)5. НМРЛ — наиболее часто диагноз злокачественных новообразований и можно подразделить различных гистологических подтипов, включая аденокарциноме легкого (LUAD) и легких плоскоклеточный рак (LUSC)6. Геномный анализ резецированный человека первичного рака легких показал, что опухоли в пределах данного histotype можно также выразить различных молекулярных возмущений, далее вклад их различные клинические прогрессии и смешанным пациента прогноз. Замечательные гетерогенность рака легких представляет собой значительный вызов рациональный дизайн, Доклинические испытания, и осуществления эффективных терапевтических стратегий. Следовательно существует необходимость расширить репертуар шансов справиться с возникающими экспериментальной легких Рак моделей для изучения различных клеточных происхождение, молекулярные подтипы и стадиях этого заболевания.
Различные подходы с использованием животных моделей были использованы для изучения легких Рак в естественных условиях, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки в зависимости от биологических вопрос(ы) интерес. Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) можно ориентировать конкретные генетические изменения в данной прародитель типа клеток, что приводит к опухоли, прогресс в рамках иммунокомпетентных принимающей7. Хотя чрезвычайно мощный, клинически значимых задержка, изменчивость и/или легких заболеваемости опухоли, связанные с GEMMs может быть непомерно высокой для определенных количественных измерений и обнаружения поздней стадии метастазирования в отдаленные органы8. Дополнительный подход является использование аллотрансплантата моделей, whereby клеток рака легкого, получены либо непосредственно от мыши опухоли или производные сначала как установленные клеточных линий в культуре, повторно введены в сингенных хостов. Аналогично от линий клеток человека или больного производных опухоли образцы устанавливаются ксенотрасплантатов рака легких. Ксенотрасплантатов линии клеток человека или больного производных ксенотрасплантатов (PDXs) обычно поддерживаются в мышах с ослабленным иммунитетом и поэтому препятствует полной иммунной наблюдения9. Несмотря на этот недостаток они обеспечивают возможность распространить ограничения количества человеческого biospecimens и исследование фундаментальных в vivo свойств человеческих раковых клеток, которые кодируют для более сложных геномной аберраций чем ГЭММ опухоли.
Одно полезное свойство аллотрансплантация тканей и ксенотрасплантатов является, что они поддаются традиционные ограничения анализов разрежения клеток, используемых для количественной оценки частоты опухоли, инициирование клетки (тики) в пределах злокачественных клеток населения10. В этих экспериментах определенное количество клеток подкожно вводят в бочку животных и частота тики могут быть оценены основе опухоли взять курс. Подкожной опухоли однако может быть более гипоксических11 и не может модель основных физиологических ограничения микроокружения опухоли легких. Доставка трахею эпителиальных стволовых и прогениторных клеток в легкие мышей является метод для изучения легких регенерации и биологии стволовых клеток дыхательных путей12. Однако приживления ставка от этой техники может быть относительно низким, если легкие сначала подвергается физиологических форм травмы, такие, как вирусная инфекция13,14. Поддержка от воспалительных стромальных клеток и/или нарушение базальной мембраны легких может улучшить удержание пересаженные клетки в соответствующих стволовых клеток ниши в дистальной airways15. Фиброз, вызывая агентов можно также предварительно состояние легких активизировать приживления индуцированных плюрипотентных клеток16 и17мезенхимальных стволовых клеток. Ли аналогичные формы повреждения дыхательных путей может повлиять на уровень приживления, инициирующей потенциала опухоли и нарост клеток рака легкого еще предстоит систематически оценивать.
В этом исследовании мы опишем способ повышения эффективности приживления ячейки рака легкого ортотопическая, путем предварительного кондиционирования легких мышей с травмой. LUAD возникает в дистальных дыхательных путях с значительное подмножество этих видов рака, развитие фиброзных стромы18 , которая часто коррелирует с плохим прогнозом19. Блеомицин, пептид гибрид естественный Нерибосомные-поликетидного, широко использовались побудить легочного фиброза в мышей20. Сократимость миокарда инстилляции блеомицин сначала способствует эпителиальных убыли в альвеолы и набор воспалительных клеток, в том числе21макрофагов, нейтрофилов и моноцитов. Это сопровождается тканей ремоделирования в дистальных дыхательных путей, базальной мембраны реорганизации22,23 и внеклеточного матрикса (ECM) осаждения24. Последствия введения единого блеомицин являются временными, с фиброзом урегулирования после 30 дней в большинстве исследований25. С помощью модели аллотрансплантата и гранулы ксенотрансплантата, мы проверили, если предварительного кондиционирования airways мышей с блеомицин может значительно увеличить скорость взять LUAD клетки в легких.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поразительные параллели клинических документально между раком легких и других хронических заболеваний легких36. В частности увеличение пристрастие для развития рака легких у пациентов с идиопатического легочного фиброза (МГЛ), и эта ассоциация независимо от курения исто?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось за счет субсидий из Национального института рака (R01CA166376 и R01CA191489 для D.X. Nguyen) и Министерство обороны (W81XWH-16-1-0227 для D.X. Nguyen).
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
- Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
- Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
- Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
- Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
- Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
- Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
- Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
- Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
- Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
- Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
- Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
- Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
- Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
- Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
- Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
- Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
- Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
- Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
- Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
- Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
- Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
- Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
- Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
- Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
- Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
- Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).
