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Medicina

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Published: June 28, 2018
doi:
10.3791/56650
, ,
1Department of Pathology,Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology,Yale University School of Medicine

Summary

Nós descrevemos um método para melhorar significativamente a enxertia ortotópico de células de câncer de pulmão aos pulmões murino pelo pré-condicionamento das vias aéreas com lesão. Esta abordagem também pode ser aplicada para estudar interações do estroma dentro do microambiente pulmonar, disseminação metastática, co-morbidades do câncer pulmonar, e gerar mais eficiência paciente derivada xenografts.

Abstract

Câncer de pulmão é uma doença refratária tratamento mortal que é biologicamente heterogênea. Para compreender e tratar eficazmente o espectro completo clínico de malignidade torácica, são necessários modelos animais adicionais que podem recapitular estágios e subtipos de câncer de pulmão humano diverso. Aloenxerto ou enxerto heterólogo modelos são versáteis e permitem a quantificação da capacidade tumorigênico em vivo, usando células malignas de origem humana ou murino. No entanto, métodos anteriormente descritos de enxertia de células de câncer de pulmão foram realizados em locais não-fisiológicas, tais como o flanco dos ratos, devido a ineficiência de transplante ortotópico de células para os pulmões. Neste estudo, descrevemos um método para melhorar a ortotópico enxertia do pulmão câncer célula pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina de agente induzindo a fibrose. Como um experimento de prova de conceito, nós aplicamos esta abordagem para engraft células tumorais de subtipo de adenocarcinoma do pulmão, obtidos de fontes humanas, ou rato em várias cepas de ratos. Demonstramos que ferir as vias aéreas com bleomicina antes da injeção de células de tumor aumenta a enxertia de células tumorais de 0-17% a 71-100%. Significativamente, esse método aprimorado incidência de tumor de pulmão e consequência subsequente usando modelos e diferentes cepas de rato. Além disso, células de câncer de pulmão engrafted disseminam dos pulmões em órgãos distantes relevantes. Assim, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para estabelecer e manter novos modelos ortotópico de câncer de pulmão com limitação da quantidade de células ou biospecimen e avaliar quantitativamente a oncogenicidade capacidade das células de câncer de pulmão em configurações fisiologicamente relevantes .

Introduction

Câncer de pulmão é a principal causa de câncer relacionados a mortes em todo o mundo1. Pacientes com câncer de pulmão eventualmente sucumbiram de metástase para órgãos distantes, nomeadamente para o sistema nervoso central, fígado, glândulas supra-renais e os ossos2,3,4. Malignidade torácica foram tradicionalmente classificada como câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) ou não-pequenas células lung cancer (NSCLC)5. CPNPC é o mais frequentemente diagnosticado malignidade e podem ser subdividido em diferentes subtipos histológicos, incluindo adenocarcinoma do pulmão (LUAD) e pulmão carcinoma de células escamosas (LUSC)6. Análise genômica dos cancros do pulmão primário humano ressecadas revelou que tumores dentro de um determinado histotype também podem expressar diversas perturbações moleculares, ainda mais, contribuindo para sua progressão clínica divergente e confundindo o prognóstico do paciente. A notável heterogeneidade dos cancros do pulmão representa um desafio significativo para o projeto racional, testes pré-clínicos e implementação de estratégias terapêuticas eficazes. Consequentemente, há uma necessidade de ampliar o repertório de modelos de câncer de pulmão experimental tractable para estudar as diversas origens celulares, subtipos moleculares e fases desta doença.

Várias abordagens usando modelos animais têm sido empregadas para estudar pulmão câncer na vivo, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens dependendo as questà µ es biológicas de interesse. Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) podem direcionar alterações genéticas específicas em um tipo de células progenitoras determinado, resultando em tumores que o progresso dentro de um hospedeiro imunocompetentes7. Embora extremamente poderoso e clinicamente relevantes, a morbidade de latência, variabilidade e/ou pulmão tumor associada com GEMMs pode ser proibitiva para certas medidas quantitativas e a detecção de metástases de fase final em órgãos distantes8. Uma abordagem complementar é o uso de modelos de aloenxerto, segundo o qual as células de câncer de pulmão, obtidos diretamente a partir de um tumor de rato ou derivado primeiro como linhagens celulares estabelecidas na cultura, são re-introduzidas em syngeneic anfitriões. De forma análoga, xenografts de câncer de pulmão são estabelecidos de amostras de paciente tumor derivado ou linhas de células humanas. Xenografts de linha celular humana ou pacientes derivadas xenografts (PDXs) são geralmente mantidos em ratos imunodeprimidos e, portanto, impedem a completa vigilância imune9. Apesar desta desvantagem, eles fornecem uma avenida para propagar a limitar as quantidades de humano biospecimens e estudo fundamental na vivo Propriedades de células cancerosas humanas, que codificam as aberrações genômicas mais complexas que os tumores GEMM.

Uma propriedade útil de aloenxertos e xenografts é que eles são receptivos a tradicional ensaios limitante de diluição de célula, empregados para quantificar a frequência de tumor iniciando células (TICs) dentro de uma população de células malignas10. Nesses experimentos, um número definido de células é injetado por via subcutânea o flanco dos animais e a frequência de tiques pode ser estimada com base na taxa de tomada de tumor. Tumores subcutâneos, entretanto, podem ser mais hipóxico11 e não podem modelo chaves restrições fisiológicas do microambiente do tumor de pulmão. Entrega de intratraqueal de tronco epitelial ou progenitoras para os pulmões de ratos é um método para estudar a regeneração pulmonar e das vias respiratórias de biologia de células-tronco12. No entanto, a taxa de enxertia desta técnica pode ser relativamente baixa, a menos que os pulmões são primeiro sujeitas a formas fisiológicas de lesão, tais como infecção viral13,14. Suporte de células estromais inflamatórias e/ou a ruptura da membrana de porão pulmão pode melhorar a retenção das células transplantadas em nichos de células-tronco relevantes na vias aéreas distais15. Fibrose, induzindo agentes também pode pre-condição os pulmões para melhorar a enxertia de células pluripotentes induzidas16 e células-tronco mesenquimais17. Se formas semelhantes de lesão das vias respiratórias podem afetar a taxa de enxertia, capacidade inicial de tumor e a consequência natural de células de câncer de pulmão deve ainda ser sistematicamente avaliada.

Neste estudo, descrevemos um método para aumentar a eficiência de ortotópico enxertia de células de câncer pulmonar, por pré-condicionamento nos pulmões de ratos com lesão. LUAD surge nas vias aéreas distais com um subconjunto significativo desses cânceres desenvolvendo um estroma fibrótico18 que muitas vezes se correlaciona com o prognóstico pobre19. Bleomicina, um peptídeo de híbrido natural nonribosomal-policetídeo, tem sido amplamente utilizada para induzir fibrose pulmonar em ratos20. Instilação de vias aéreas de bleomicina promove primeiro atrito epitelial nos alvéolos e recrutamento de células inflamatórias, incluindo macrófagos, neutrófilos e monócitos21. Isto é seguido por tecido remodelação nas vias aéreas distais, membrana basal reorganização22,23 e deposição de matriz extracelular (ECM)24. Os efeitos de uma injeção de bleomicina único são transitórios, com fibrose resolvendo após 30 dias na maioria dos estudos25. Usando modelos tanto aloenxertos e xenoenxertos, testamos se pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina poderia aumentar significativamente a taxa de tomada de células LUAD nos pulmões.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na Universidade de Yale. 1. configurar / preparação dos reagentes. BleomicinaAtenção: Com base na globalmente harmonizado sistema (GHS) de classificação e rotulagem de produtos químicos, bleomicina é classificada como um perigo para a saúde GHS08. Prepare a bleomicina em uma capa de química….

Representative Results

Para aumentar a eficiência da enxertia de célula de câncer LUAD nos pulmões de ratos, desenvolvemos um protocolo que primeiro pre-condições das vias aéreas utilizando a bleomicina seguida por injeção de células de tumor ortotópico (Figura 1). Confirmamos que, mesmo quando administrado em ratos imunodeprimidos modelo, bleomicina induzido fibrose transitória por dia 14, como evidenciado pela perda da arquitetura das vias aéreas e a deposição de c…

Discussion

Marcantes clínicos paralelos foram documentados entre câncer de pulmão e outras doenças crônicas do pulmão36. Em particular, pacientes com fibrose pulmonar idiopática (IPF) tem uma predileção maior para desenvolver câncer de pulmão, e esta associação é independente de fumar história37,38. IPF é caracterizada pela destruição progressiva da arquitetura pulmonar e insuficiência respiratória através da deposição de ECM<s…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado por concessões do Instituto Nacional de câncer (R01CA166376 e R01CA191489 para D.X. Nguyen) e o departamento de defesa (W81XWH-16-1-0227 para D.X. Nguyen).

Materials

Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair – To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. –
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) –
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 –
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 –
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Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).
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