Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır
Summary
Biz önceden airways yaralanma ile Klima tarafından fare ciğerlerine akciğer kanser hücrelerinin orthotopic engraftment önemli ölçüde geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım aynı zamanda akciğer microenvironment, metastatik yayılması, akciğer kanseri komorbiditeler içinde stromal etkileşimleri çalışmaya uygulanabilir ve daha verimli bir şekilde hasta oluşturmak için xenografts türetilmiş.
Abstract
Akciğer kanseri biyolojik olarak heterojen bir ölümcül tedavi ateşe dayanıklı hastalıktır. Anlama ve etkili bir şekilde göğüs maligniteler tam klinik spektrumu için çeşitli insan akciğer kanseri alt türlerini ve aşamaları özetlemek ek hayvan modelleri ihtiyaç vardır. Homogreft veya xenograft modelleri çok yönlü ve tumorigenic kapasite vivo içindefare ya da insan kökenli malign hücreler kullanarak, miktar etkinleştirin. Ancak, önceden açıklanan yöntemleri akciğer kanseri hücre engraftment, farelerin orthotopic nakli hücrelerin ciğerlerine verimsizlik nedeniyle kanadı gibi fizyolojik olmayan sitelerdeki gerçekleştirilmiş. Bu çalışmada, orthotopic akciğer kanseri hücre engraftment fibrozis inducing Ajan bleomycin ile fareler airways önceden Klima tarafından geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir prototip deney olarak, biz bu yaklaşım tümör hücreleri ya fare veya insan kaynakları, fareler çeşitli suşları aldığınız akciğer adenokarsinom alt türündeki engraft uygulanır. Biz airways bleomycin önce tümör hücre enjeksiyon ile ağır yaralı tümör hücreleri 0-17 engraftment artırır göstermek % 71-%100. Önemli ölçüde, bu yöntem Gelişmiş akciğer tümörü insidansı ve sonraki akıbet farklı modeller ve fare suşları kullanarak. Buna ek olarak, engrafted akciğer kanser hücrelerini akciğerlerden ilgili uzak organlara yaymak. Böylece, kurmak ve yeni orthotopic modelleri akciğer kanseri hücreleri veya biospecimen miktarda sınırlama ile korumak ve kantitatif akciğer kanser hücrelerini fizyolojik ilgili ayarları tumorigenic kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir bir protokol sağlar .
Introduction
Akciğer kanseri olduğu önde gelen kanser nedeni ile ilgili ölümlerin dünya çapında1. Akciğer kanseri olan hastalarda sonunda metastaz yenik uzak organlara, özellikle merkezi sinir sistemi, karaciğer, böbrek üstü bezleri ve kemikler2,3,4. Torasik maligniteler geleneksel olarak küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) veya küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC)5sınıflandırılmış. NSCLC en sık malignite tanısı ve akciğer adenokarsinom (LUAD) ve akciğer Skuamöz Hücre Karsinomu (LUSC)6dahil olmak üzere farklı histolojik alt alt olduğunu. Genomik analiz rezeke insan birincil akciğer kanserlerinin tümörler belirli bir histotype içinde de daha fazla onların farklı klinik ilerleme katkıda bulunmak ve hastanın prognozu semptomlarıdır çeşitli moleküler tedirginlikler hızlı ortaya koymuştur. Akciğer kanserleri olağanüstü heterojen rasyonel tasarım, önceden klinik test ve etkili tedavi stratejileri uygulanması için önemli bir sorun temsil eder. Sonuç olarak, uysal deneysel akciğer kanser modelleri çeşitli hücresel kökenleri, moleküler alt türlerini ve bu hastalık aşamalarında çalışmaya repertuarı genişletmek için bir ihtiyaç vardır.
Hayvan modellerini kullanarak çeşitli yaklaşımlar akciğer kanseri vivo içindeher biri kendi avantajları ve dezavantajları biyolojik soru (lar) ilgi bağlı olarak çalışmaya istihdam edilmiştir. Genetiği fare modelleri (GEMMs) tümörleri içinde bu ilerleme bir immün konak7içinde kaynaklanan bir verilen progenitör hücre tipi belirli genetik değişiklikler hedefleyebilirsiniz. Son derece güçlü ve klinik, gecikme süresi, değişkenlik ve/veya akciğer tümörü morbidite GEMMs ile ilişkili belirli nicel ölçümler ve uzak organlara8geç sahne metastaz tespiti için engelleyici olabilir. Sayede akciğer kanser hücrelerini, ya doğrudan bir fare tümör elde edilen veya ilk kurulan hücre satırlar halinde kültür, türetilmiş syngeneic ana bilgisayarları yeniden kullanılmaya homogreft modellerinin kullanımı tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Mahsum, akciğer kanseri xenografts insan hücre hatları veya hasta türetilmiş tümör örnekleri kurulur. İnsan hücre satır xenografts veya hasta türetilmiş xenografts (PDXs) immün fareler genellikle korunur ve bu nedenle tam bağışıklık-gözetim9engel. Bu dezavantajı rağmen tutarlar için et tümörler daha daha karmaşık genomik aberasyonları kodlamak insan kanser hücrelerinin insan biospecimens ve çalışma temel in vivo özelliklerinin sınırlama yaymak için bir cadde sağlarlar.
Bir yararlı özelliği, allogrefler ve xenografts onlar tümör hücreleri (tikler) bir malign hücre nüfus10içinde başlatma sıklığını ölçmek için kullanılan geleneksel sınırlayıcı hücre seyreltme deneyleri, mükellef olmasıdır. Bu deneylerde, tanımlı bir hücre sayısı subkutan hayvanlar kanat enjekte edilir ve tikler sıklığını tümörü almak oranı dayalı tahmin edilebilir. Subkutan tümörler ancak daha hipoksik11 olabilir ve fizyolojik kısıtları anahtar: akciğer tümörü microenvironment model değil. Ciğerlerine farelerin epitel kök veya progenitör hücrelerin boğaza teslimat Akciğer rejenerasyon ve hava yolu kök hücre biyolojisi12çalışmaya bir yöntemdir. Ancak, akciğerleri ilk yaralanma, viral enfeksiyon13,14gibi fizyolojik formlara tabi olan sürece bu teknik engraftment oranı nispeten düşük olabilir. Destek inflamatuar stromal hücrelerden ve/veya akciğer membran bozulma saklama transplante hücre içine ilgili kök hücre nişler distal havayolları15artırabilir. Ajanlar inducing fibrozis de önceden engraftment indüklenmiş pluripotent hücreler16 ve mezenkimal kök hücre17geliştirmek akciğerlerinin durumu. Hava yolu yaralanma benzer formları engraftment oranı etkileyebilir olsun, tümör Başlatan kapasite ve akciğer kanser hücrelerini akıbet henüz sistematik olarak değerlendirilmesi için.
Bu çalışmada, yaralanma ile fareler akciğerler önceden Klima tarafından orthotopic akciğer kanseri hücre engraftment, verimliliğini artırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. LUAD distal airways kez kötü prognoz19ile karşılıklı olarak ilişkilendirir fibrotik stroma18 geliştirme bu kanser, önemli bir alt ile doğar. Bleomycin, bir doğal nonribosomal hibrid peptid-polyketide, pulmoner fibrozis fareler20de ikna etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bleomycin hava yolu korumak ilk epitel yıpratma alveoller ve inflamatuar hücreler, makrofajlar, nötrofil ve monosit21dahil alımı teşvik etmektedir. Bu doku distal airways, membran yeniden yapılanma22,23 ve hücre dışı matriks (ECM) ifade24remodeling tarafından takip ediyor. Bir tek bleomycin enjeksiyon etkileri geçicidir, çoğu çalışmalar2530 gün sonra çözme fibrozis ile. Bleomycin ile fareler airways önceden Klima önemli ölçüde akciğer hücrelerinde LUAD almak oranı artış olabilir Eğer homogreft ve xenograft modelleri kullanarak, test ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akciğer kanseri ve diğer kronik hastalıklar akciğer36arasında çarpıcı klinik paralellikler belgelenmiştir. Özellikle, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) olan hastalarda gelişen akciğer kanseri için artan bir tercih var ve bu ilişki geçmiş37,38sigara bağımsızdır. IPF ilerici imha akciğer mimarisi ve bozulmuş solunum işlevini, ECM39birikimi ile karakterizedir. Ayrıca, cerrahi rezeksiyon bir zav…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA166376 ve R01CA191489 D.X. Nguyen için) ve Savunma Bakanlığı (W81XWH-16-1-0227 D.X. Nguyen için) gelen hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
- Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
- Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
- Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
- Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
- Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
- Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
- Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
- Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
- Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
- Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
- Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
- Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
- Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
- Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
- Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
- Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
- Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
- Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
- Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
- Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
- Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
- Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
- Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
- Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
- Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
- Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).
