Une méthode pour la Transplantation d’îlots à l’épiploon dans la souris
Summary
On introduit une méthode pour l’épiploïques transplantation d’îlots dans une souris. Les îlots sont mélangés avec hydrogel et le mélange est placé dans la pochette omentaux de souris diabétique. Ensuite, la glycémie est contrôlée et l’analyse immuno-histochimique est réalisée.
Abstract
La transplantation d’îlots a été proposée pour être un traitement potentiel pour le diabète de type 1. Des preuves convaincantes récente indiquent qu’îlot intravasculaire infusion est loin d’être idéale et par conséquent, l’épiploon est ré-émergent comme un site potentiellement intéressants pour la transplantation d’îlots. Cette expérience nécessite l’isolement des îlots de haute qualité et l’implantation des îlots aux personnes diabétiques. Transplantation à l’épiploon requiert des étapes chirurgicales qui peuvent mieux démontrer visuellement. Ici, les étapes détaillées pour cette procédure sont présentés. Deux méthodes de mélange des îlots isolés avec hydrogel avant de placer le mélange dans la poche épiploïques des souris diabétiques sont décrites ici. Hydrogels différents sont utilisés pour les différentes conditions. Le taux de glucose sanguin des récipiendaires de souris diabétiques des îlots syngéniques dans l’épiploon ont été suivi pendant 35 jours. Certains animaux ont été sacrifiés après 14 jours pour réaliser une analyse immunohistochimique. Cette approche de transplantation préclinique peut servir de données préliminaires menant à la traduction de transplantation clinique.
Introduction
Selon la Fédération internationale du diabète (FID), mellitus de diabète touche actuellement 382 millions de personnes, avec une augmentation prévue à 592 millions de personnes par 20351. Dans les deux greffes d’îlots xénogéniques et allogéniques, traitement immunosuppresseur systémique est nécessaire. Sans immunosuppression, rejet immunitaire est une cause majeure de perte de greffon2. Il y a aussi un grave problème de perte des îlots transplantés en raison du sang immédiate médiée par réaction inflammatoire (IBMIR)3,4. Cependant, même en l’absence d’une réponse immunitaire comme syngéniques ou modèles auto-transplantation, des cellules des îlots transplantés dans le foie via la veine porte sont perdues en raison d’une inflammation et/ou à des conditions environnementales défavorables, tels que le mauvais sang d’alimentation avec oxygénation réduite et/ou nutriments5,6. Ainsi, afin d’assurer des fonctions métaboliques à long terme, îlot des nombres plus élevés sont nécessaires pour compenser la perte de la cellule initiale qui réduit la prise de greffe7.
Dans le but d’optimiser la greffe d’îlots pancréatiques, plusieurs sites anatomiques alternatifs ont été étudiées expérimentalement ainsi que sur le plan clinique, avec prometteur, encore non définitif résultats8. Considérant que certains des sites alternatifs offrent un accès facile et sûr (par exemple., la peau, capsule rénale, sous-muqueuse gastrique et la chambre antérieure de le œil) ou une surface plus large pour les plus grandes masses d’îlot (e.g., cavité péritonéale), survie et physiologiques rendement métabolique des îlots transplantés sont encore limitée et demeurent une préoccupation9. La recherche d’un site plus approprié pour la greffe d’îlots pancréatiques est en cours.
L’épiploon était parmi les nombreux sites anatomiques qui ont été étudiés dans le développement de la transplantation d’îlots et s’est avérés un environnement fructueux pour les îlots10,11,12,13, 14. Cependant, perfusion intraporte îlot est devenu la raison choice clinique en partie à la relative simplicité de la procédure, et le succès rapide des animaux modèles6. Aussi, en partie, les négatifs associés avec ce site, perte d’îlot précoce particulièrement massive, étaient moins connus et moins contraignante dans les premiers jours de la transplantation d’îlots expérimentale que le champ est arrivée à échéance. Avec les plus récentes preuves convaincantes indiquant que la perfusion intravasculaire îlot est loin d’être idéale, l’épiploon est ré-émergent comme un site potentiellement intéressants pour la transplantation de cellules.
L’épiploon (sous la forme d’une poche épiploïques) offre des avantages relatifs sur le foie15,16. Elle est très vascularisée et facilement accessible. Il permet la récupération de la prothèse (si nécessaire) et/ou une biopsie. La période ischémique vécue par les îlots est réduite par rapport au foie, et l’épiploon peut accepter relativement masses grand îlot qui n’est pas possible au, où une augmentation de la pression portale peuvent entraîner des complications.
Un modèle de souris syngénique des greffes a été utilisé dans le protocole testé dans l’étude, qui emploient les souris C57BL/6 mâles entre 6 à 8 semaines avec un poids de 20 – 25 bénéficiaires îlot g. ont été rendus diabétiques avec une seule injection de streptozotocine avec une dose de 250 mg/kg ip. L’induction du diabète peut être considéré comme réussie si le niveau de glucose sanguin de la souris est supérieur à 24 mmol/L 48 h après l’injection et se maintient au-dessus de ce niveau pendant au moins 5 jours.
Syngéniques îlots ont été isolés par le pancréas des donneurs appariés selon l’âge suivant des méthodes publiées antérieurement avec quelques modifications. En bref, la collagénase a été injecté dans la vésicule biliaire au lieu de la voie biliaire. Cela a été fait comme une amélioration pour faciliter l’injection. Infusion de collagénase a été suivie de l’incubation, perturbation du tissu, séparation gradient de densité et de cueillette à la main pour obtenir des îlots pures. Îlots ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu CMRL-1066 additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans des flacons de T175 à 37 ° C, moins 95 % de l’air – 5 % CO2 avant la transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transplantation d’îlots pancréatiques pour le foie via la veine porte est la plus couramment utilisée méthode de transplantation d’îlots pancréatiques chez l’homme, mais il y a encore des préoccupations de l’efficacité et la sécurité comme veine thrombose et foie stéatose17. Des études récentes montrent que l’épiploon peut être une alternative appropriée pour le foie, mais des efforts supplémentaires de recherche à effectuer avant la traduction clinique<sup class="xref"…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Certains des auteurs de ces travaux appuyés en partie par des subventions du National clé de R & D programme de la Chine (2017YFC1103704), Sanming projet de médecine à Shenzhen (SZSM201412020), fonds de haut niveau médical Discipline Construction de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), fondation de Shenzhen de la santé et de la Commission de planification familiale (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
Referencias
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