Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse
Summary
È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l’analisi immuno-istochimica.
Abstract
Trapianto dell’isolotto è stato proposto per essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Convincente la prova recente indica che l’infusione intravascolare isolotto è tutt’altro che ideale e di conseguenza, l’omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto dell’isolotto. Questo esperimento richiede l’isolamento degli isolotti di alta qualità e l’impianto degli isolotti ai destinatari diabetici. Trapianto al omento richiede passaggi chirurgiche che possono essere meglio dimostrati visivamente. Qui, vengono presentati i passaggi dettagliati per questa procedura. Qui sono descritti due metodi di miscelazione isolotti isolati con idrogel prima di mettere la miscela nel sacchetto omentale di topi diabetici. Idrogeli differenti sono utilizzati per le diverse condizioni. Livelli di glucosio nel sangue dei destinatari di topo diabetico di isolotti syngeneic nell’omento sono stati controllati per fino a 35 giorni. Alcuni animali sono stati sacrificati dopo 14 giorni per eseguire analisi immuno-istochimica. Questo approccio pre-clinica di trapianto può essere utilizzato come dati preliminari che portarono alla traduzione a trapianto clinico.
Introduction
Secondo l’International Diabetes Federation (IDF), diabete mellito colpisce attualmente 382 milioni di persone, con un aumento previsto di persone 592 milioni di 20351. In entrambi trapianto di insule pancreatiche allogeniche e xenogeniche, terapia immunosoppressiva sistemica è necessaria. Senza immunosoppressione, rigetto immunitario è delle principali cause di perdita di innesto2. C’è anche un significativo problema di perdita dell’isolotto trapiantato dovuto il sangue istantaneo mediata reazione infiammatoria (IBMIR)3,4. Tuttavia, anche in assenza di una risposta immunitaria come syngeneic o modelli di auto-trapianto, cellule delle isole trapiantate nel fegato tramite la vena portale sono persi a causa di infiammazione e/o a condizioni ambientali sfavorevoli, come sangue povero alimentazione con ridotta ossigenazione e/o sostanze nutritive5,6. Di conseguenza, al fine di garantire a lungo termine funzione metabolica, numeri più alti dell’isolotto sono necessari per compensare la perdita di cellule iniziali che riduce il engraftment7.
Nel tentativo di ottimizzare attecchimento dell’isolotto, diversi siti anatomici alternativi sono stati studiati sperimentalmente come pure clinicamente, con promettenti, ma non definitivo risultati8. Considerando che alcuni dei siti alternativi offrono un accesso facile e sicuro (ad es., pelle, capsula del rene, submucosa gastrico e camera anteriore dell’occhio) o una superficie più ampia per grandi masse dell’isolotto (ad es., cavità peritoneale), sopravvivenza e fisiologico prestazione metabolica delle isole trapiantate sono ancora limitate e rimangono una preoccupazione9. La ricerca di un sito più adatto per attecchimento dell’isolotto è in corso.
L’omento è stato tra i tanti siti anatomici che sono stati studiati nello sviluppo iniziale di trapianto dell’isolotto e si è rivelati un ambiente di successo per gli isolotti10,11,12,13, 14. Tuttavia, infusione intraportal isolotto è diventato il clinico dovuto scelta in parte per la relativa semplicità della procedura e primi successi nell’animale modelli6. Inoltre, in parte, gli aspetti negativi associati con questo sito, particolarmente massiccia perdita iniziale dell’isolotto, erano meno comprensibili e meno vincolante nei primi giorni di trapianto dell’isolotto sperimentale come il campo maturata. Con più recente prova coercitiva che indica che l’infusione intravascolare isolotto è ben lungi dall’ideale, omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto di cellule.
L’omento (sotto forma di un sacchetto omentale) offre vantaggi relativi sopra il fegato15,16. È bene-vascularized e facilmente accessibile. Esso consente il recupero di innesto (se necessario) e/o biopsia. Il periodo ischemico sperimentato dagli isolotti è ridotto rispetto al fegato, e l’omento può accettare relativamente masse di grande isolotto che non è possibile intraportally, dove un aumento della pressione portale possono causare complicazioni.
Un modello syngeneic del topo del trapianto è stato usato nel protocollo testato nello studio, che impiegano i topi maschii C57BL/6 tra 6 – 8 settimane con un peso corporeo di 20 – 25 destinatari dell’isolotto di g. sono stati resi diabetici con una singola iniezione dello streptozotocin con una dose di 250 mg/kg ip. L’induzione del diabete può essere considerato riuscito se il livello di glucosio nel sangue del mouse è maggiore di 24 mmol/L 48 h dopo l’iniezione e rimane sopra quel livello per un minimo di 5 giorni.
Isolotti syngeneic sono stati isolati dal pancreas di pari età donatori seguendo metodi precedentemente pubblicati con alcune modifiche. In breve, la collagenasi è stato iniettato nella vescica di scorticatura invece il dotto biliare. Questo è stato fatto come un miglioramento per facilitare la facilità di iniezione. Collagenasi infusione è stata seguita da incubazione, la rottura del tessuto, separazione di gradienti di densità e raccolta a mano per ottenere puri isolotti. Gli isolotti sono stati coltivati durante la notte in CMRL-1066 supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in matracci T175 a 37 ° C, meno 95% aria – 5% CO2 prima del trapianto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trapianto dell’isolotto al fegato tramite la vena portale è il più diffuso metodo di trapianto dell’isolotto in esseri umani, ma ci sono ancora problemi di efficienza e sicurezza come vena portale trombosi e fegato steatosi17. Studi recenti dimostrano che l’omento può essere un’alternativa adatta per il fegato, ma più ricerca deve essere condotta prima della traduzione clinica12,14,18,<sup …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alcuni degli autori di questo lavoro sono state sostenute in parte dalle concessioni dal nazionali chiave R & D programma della Cina (2017YFC1103704), progetto di Sanming di medicina a Shenzhen (SZSM201412020), fondo per l’alto livello medico disciplina costruzione di Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fondazione di scienza e tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fondazione di Shenzhen della salute e della Commissione di pianificazione familiare (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
Referencias
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