ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة
Summary
ويرد على بروتوكول تحضير البولي فينيل الكحول-co-إيتاكونيك الهلاميات المائية الحمضية بصلابة متفاوتة، التي كانت المطعمة مع أو بدون أوليجوبيبتيديس، للتحقيق في تأثير صلابة الحيوية على التفرقة وانتشار الخلايا الجذعية. وتسيطر صلابة من الهلاميات المائية الوقت كروسلينكينج.
Abstract
تأثير الرموز المادية، مثل تصلب الحيوية في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية، وكانت قد أجرت التحقيق العديد من الباحثين. ومع ذلك، استخدمت معظم هؤلاء المحققين polyacrylamide الهلاميات المائية لاستزراع الخلايا الجذعية في دراساتهم. ولذلك، نتائجها مثيرة للجدل لأن هذه النتائج قد تنشأ من الخصائص التي تنفرد بها بولياكريلاميدي وليس من الرمز المادي (تصلب) الحيوية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الهلاميات المائية، التي لا تستند إلى بولياكريلاميدي، حيث يمكن أن تكون مثقف مختلف الجذعية والخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES) والبشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (iPS)،. وأعدت الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة من بيوينيرت البولي فينيل الكحول-co-إيتاكونيك حامض (ف-IA)، مع تصلب تسيطر عليها درجة كروسلينكينج بتغيير الوقت كروسلينكينج. وتم التحقيق الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع أو بدون أوليجوبيبتيديس المستمدة من المصفوفة خارج الخلية كمنصة مستقبل لزراعة الخلايا الجذعية وتمايزها. ويرد في الثقافة ومرور السائل السلوى في مجال الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وحقوق دإط الخلايا والخلايا البشرية المتكاملة هنا بالتفصيل. وأظهرت الهلاميات المائية أوليجوبيبتيدي ف-IA متفوقة الأداء، التي كانت تحدثها خصائصها صلابة. هذا البروتوكول تقارير توليف مادة بيولوجية، التلاعب بهم السطحية، جنبا إلى جنب مع التحكم في خصائص صلابة، وأخيراً، أثرها على مصير الخلايا الجذعية باستخدام شروط ثقافة خالية من كرة. استناداً إلى الدراسات التي أجريت مؤخرا، مثل ركائز المعدلة يمكن أن تعمل كمنصات مستقبلا لدعم وتوجيه مصير مختلف خط الخلايا الجذعية للروابط المختلفة؛ وعلاوة على ذلك، تجديد واستعادة وظائف الجهاز المفقودة أو الأنسجة.
Introduction
يعرف مصير تمايز الخلايا الجذعية إلى نسب محددة للخلايا وانتشار طويلة الأجل للخلايا الجذعية، ولا سيما البشرية المستحثة pluripotent (iPS) الخلايا والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES)، ينظمها مثبطات، عوامل النمو، و/ أو صغيرة الجزيئات النشطة بيولوجيا في ثقافة وسائل الإعلام. في الآونة الأخيرة، تم الاعتراف العظة المادية الحيوية، لا سيما صلابة خلية الثقافة الحيوية، لتكون عاملاً مهما في توجيه مصير الخلايا الجذعية الانتشار والتمايز1،2، 3،4،،من56. ولذلك، بدأ الباحثون عدة للتحقيق في مصير الخلايا الجذعية، التي تستزرع في الهلاميات المائية، على التمايز، أساسا باستخدام polyacrylamide الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة.
يمكن التحكم صلابة الحيوية الالتصاقات المحورية ومورفولوجيا الخلايا، خلية النمط الظاهري والتصاق الخلايا الجذعية، لا سيما في ثنائي الأبعاد (2-d) زراعة1،2،،من35. الاستشعار عن بعد Mechano الحيوية بالخلايا الجذعية عموما يسيطر التصاق تركيز إشارات عبر مستقبلات إنتغرين. نمييا، نونموسكلي الميوسين كونتراكتيليتي تعتمد على معهد مراجعي الحسابات الداخليين من سيتوسكيليتون أكتين يلعب دوراً حاسما في عملية ميتشانوسينسينج للخلايا الجذعية في الخلية 2-د زراعة النظم3،،من45، 7،،من89،،من1011.
انجلر وزملائه بوضع فكرة مثيرة لاهتمام أن الخلايا الجذعية البالغة، مثل الخلايا الجذعية (خدمات إدارة المباني) نخاع العظام المزروعة في خلية الثقافة الحيوية مع صلابة مماثلة لانسجة محددة، تميل إلى التفريق في الخلايا التي نشأت من 5من أنسجة محددة. خدمات إدارة المباني الخلايا المحتضنة على polyacrylamide ناعمة 2-د الهلاميات المائية مغطاة بطبقة الكولاجين النوع الأول (مع صلابة مماثلة لانسجة المخ) في التوسع في وسائل الإعلام كانت المستحث تلقائياً تفرق في وقت مبكر العصبية الأنساب، بينما مثقف خلايا خدمات إدارة المباني في الهلاميات المائية مع تصلب مماثل للعضلات أو الأنسجة العظام collagenous وجد أن يحفز التمايز في وقت مبكر الأنساب myocytes وخلايا الاوستيوبلاستس، على التوالي، في الهلاميات المائية polyacrylamide 2-د3،5. وحققت العديد من الباحثين مصير تمايز الخلايا الجذعية المستزرعة في polyacrylamide الهلاميات المائية المعطل تداولها مع الكولاجين النوع الأول من12،،من1314،،من1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21-ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تقارير بعض متناقضة1،18،22،،من2324 موجودة لفكرة معروفة واقترح قبل انجلر et al. 5 هذا بسبب انجلر في فكرة5 وضعت فقط على polyacrylamide الهلاميات المائية ونتائجها قد نشأت من الخصائص المحددة لمادة بيولوجية (polyacrylamide)، وليس فقط من الرمز المادي (تصلب) من مادة بيولوجية. ولذلك، من المهم تطوير نوع آخر من المائية، التي يمكن التحكم بصلابة قبل crosslinking من الهلاميات المائية. ولهذا الغرض، وضعت الهلاميات المائية بيوينيرت، التي أعدت من البولي فينيل حمض الكحول-co-إيتاكونيك (ف-IA) مع صلابة مختلفة، التي كان يسيطر عليها درجة كروسلينكينج مع متغيرة crosslinking وقت25، 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32-يمكن زراعة الخلايا الجذعية في نونموديفيد ف-IA الهلاميات المائية، فضلا عن ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بمصفوفات خارج الخلية (ECMs) وأوليجوبيبتيديس. في دراسة سابقة25، كانت تزرع الخلايا الجذعية البشرية المكونة للدم (هسكس) من دم الحبل السري في ف-IA الهلاميات المائية مع قيم صلابة مختلفة تتراوح الجيش الشعبي الكوري 3 إلى 30 معامل التخزين الجيش الشعبي الكوري حيث فيبرونيكتين أو أوليجوبيبتيدي المستمدة من وكان المطعمة فيبرونيكتين (CS1, ايلدفبست) إلى الهلاميات المائية ف-IA. ولوحظ عالية السابقين فيفو التوسع في حظيرة هسكس في الهلاميات المائية ف-IA المطعمة ب CS1 أو فيبرونيكتين، الذي عرض صلابة متوسطة تتراوح بين 12 الجيش الشعبي الكوري إلى 30 كيلو باسكال25.
لا تزرع iPS البشرية وخلايا ES في زراعة الأنسجة التقليدية البوليستيرين (TCP) الأطباق33،34 لوفاق البشرية وخلايا iPS تتطلب ملزمة محددة إلى ECMs، مثل فيترونيكتين أو لامينين للحفاظ على ما بلوريبوتينسي خلال الثقافة طويلة الأجل. ولذلك، صممت عدة هياكل المطعمة أوليجوبيبتيدي الهلاميات المائية ف-IA مع خصائص صلابة الأمثل وإعدادها في تشكيلات من سلسلة واحدة، وسلسلة واحدة مع جزء مشترك، وسلسلة مزدوجة مع جزء مشترك، ونوع تشعبت سلسلة32. تسلسل أوليجوبيبتيدي اختيرت من مجالات ربط إنتغرين و glycosaminoglycan ECMs. الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع أوليجوبيبتيديس المستمدة من فيترونيكتين مع سلسلة مزدوجة أو الجزء المشترك، الذي يكون معامل تخزين في حوالي 25 الجيش الشعبي الكوري، دعم ثقافة طويلة الأجل ES البشرية وخلايا iPS لما يزيد على 12 من الممرات تحت خالية من كرة والكيميائية 32من شروط محددة. الجزء المشترك وسلسلة مزدوجة مع جزيئات التصاق الخلية في الهلاميات المائية يسرت الانتشار والخلايا بلوريبوتينسي البشرية وفاق والبرامج المتكاملة32. هنا، المطعمة بروتوكول لإعداد الهلاميات المائية ف-IA (مع معامل تخزين من الجيش الشعبي الكوري 10 إلى 30 الجيش الشعبي الكوري، الذي تم قياسه تحت ظروف رطبة في الهواء) مع أو بدون أوليجوبيبتيديس أو هو وصف ECMs. ويبين كيف أن الثقافة ومرور العديد من الخلايا الجذعية (بما في ذلك الخلايا الجذعية السائل السلوى والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وحقوق دإط الخلايا والخلايا البشرية المتكاملة).
Protocol
Representative Results
Discussion
وتم وضع ف-IA-أوليجوكم والهلاميات المائية ف-IA-إدارة المحتوى في المؤسسة مع صلابة متفاوتة لتوسيع المدى الطويل ES البشرية وخلايا iPS الاحتفاظ بهم بلوريبوتينسي لأكثر من عشر فقرات في ظروف خالية من كرة، فضلا عن ثقافة المؤسسة الخلايا البشرية، إعلان الخلايا، والخلايا الجذعية المكونة للدم25<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان جزئيا تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا، وتايوان تحت أرقام المنح-003 106-2119-M-008، 105-2119-M-008-006، و 104-2221-E-008-107-MY3. وأيد هذا البحث أيضا “مشروع مستشفى لاندسيد تايوان” (حاصلين-لش-105-أ-001). من المعترف به أيضا معونات “البحث العلمي” (رقم 15 ك 06591) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان. أ هيجوتشي تود أن تقر للبرنامج الدولي للشراكة العلمية (ايسب-0062) “وكالة الجامعة” للدراسات العليا والبحوث، جامعة الملك سعود، الرياض 11451، المملكة العربية السعودية.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Referencias
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
