İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels
Summary
Bir protokol olan ve olmayan oligopeptides, biyomalzemeler farklılaşması üzerine sertliği etkisini ve yayılması araştırmak için aşılı değişen sertlik ile polivinil alkol-co-İtakonik asit hydrogels hazırlamak için sunulan kök hücreler. Hydrogels sertliği crosslinking zaman tarafından kontrol ediliyordu.
Abstract
Biyomalzeme yayılması üzerine sertliği ve kök hücre, farklılaşma gibi fiziksel yardımlar etkisi çeşitli araştırmacılar tarafından araştırmış. Ancak, çoğu bu müfettişler çalışmalarına kök hücre kültüründe polyacrylamide hydrogels kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu sonuçlar polyacrylamide belirli özellikleri ve Biyomalzeme fiziksel işaret (sertlik) kaynaklı çünkü onların sonuçları tartışmalı. Burada, biz nerede çeşitli kök, insan embriyonik kök (ES) hücre de dahil olmak üzere hücreleri ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök (IPS) hücreler, kültürlü polyacrylamide üzerinde temel almayan hydrogels hazırlanması için bir protokol tanımlamak. Hydrogels değişen sertlik ile bioinert polivinil alkol-co-İtakonik asit (P-IA) crosslinking zaman değiştirerek crosslinking derecesi tarafından kontrol edilen sertlik ile hazırlanmıştır. Ve hücre dışı matriks türetilmiş oligopeptides olmadan aşılı P-IA hydrogels kök hücre kültür ve farklılaşma için gelecek bir platform olarak araştırıldı. Kültür ve amniyotik sıvı kök hücre, kök hücre yağ elde edilen, insan ES hücreleri ve insan IP’leri hücreleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Chowing P-IA hydrogels sertlik özelliklerini tarafından indüklenen üstün performans gösterdi. Bu iletişim kuralı biomaterial, sertlik özelliklerini ve son olarak, kök hücre kader xeno-Alerjik kültür koşul kullanma üzerindeki etkilerini kontrol ile birlikte onların yüzey işleme sentezi bildirir. Son çalışmalar üzerinde bağlı olarak, değiştirilmiş gibi yüzeylerde desteklemek ve farklı bağlantılar için farklı kök hücre satır kaderi yönlendirmek için gelecekteki platformlar olarak işlev görebilir; ve ayrıca, yeniden ve kayıp organ veya doku işlevlerini geri yüklemek.
Introduction
Kök hücre farklılaşması hücre ve kök hücreleri, özellikle İnsan İndüklenmiş pluripotent (IPS) hücreleri ve insan embriyonik kök (ES) hücreleri, uzun vadeli yayılması belirli bir soy içine kaderi inhibitörleri, büyüme faktörleri, düzenlenmiş olması bilinmektedir ve / ya da küçük biyoaktif moleküller kültür medya. Son zamanlarda, biyomalzemeler, özellikle hücre kültür Biyomalzeme, sertliği fiziksel ipuçları kök hücre çoğalması ve farklılaşma1,2kaderi rehberlik önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir, 3,4,5,6. Bu nedenle, çeşitli araştırmacılar kök hücre farklılaşması, üzerine hydrogels üzerinde kültürlü, kaderi araştırmak esas olarak polyacrylamide hydrogels ile değişen sertlik kullanmaya başlamıştır.
Biyomalzeme sertliği odak yapışıklıklar, hücre morfolojisi, hücre fenotip ve özellikle de iki boyutlu (2B) ekimi1,2,3,5kök hücre adezyon denetleyebilirsiniz. Mekanik algılamalı Biyomalzeme kök hücreleri tarafından genellikle odak yapışma integrin reseptörleri sinyal tarafından kontrol edilir. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-bağımlı contractility aktin sitoiskeleti, 2-B hücre işleme sistemleri3,4,5, kök hücrelerin mechanosensing sürecinde kritik bir rol oynar 7,8,9,10,11.
Engler ve meslektaşları gibi kemik iliği kök (BMS) hücre hücre kültür Biyomalzeme bu belirli dokuların için benzer bir sertlik ile ekili erişkin kök hücreleri kökenli hücrelerine ayırt etmek eğilimindedir ilginç bir fikir geliştirdi belirli doku5. 2-B yumuşak polyacrylamide hydrogels ben (ile beyin dokuları karşılaştırılabilir bir sertlik) genişleme medya kendiliğinden indüklenen erken nöron soy ayırt etmek için üzerinde BMS hücreler kültürlü ise kollajen türüyle kaplı üzerinde BMS hücreleri inkübe hydrogels kas veya kolajen kemik doku, benzer bir sertlik ile erken soy içine farklılaşma miyositler ve dokusunu, sırasıyla, 2-B polyacrylamide hydrogels3,5tarihinde ikna etmek için bulunamadı. Pek çok araştırmacı farklılaşma kök hücre kaderi araştırdık kültürlü polyacrylamide üzerinde kollajen ile immobilize hydrogels tip ı12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21.1,bazı çelişkili raporlar belirtilmelidir ancak,18,22,23,24 var Engler tarafından önerilen tanınmış fikir için vd. 5 bunun nedeni Engler’ın fikir5 sadece polyacrylamide hydrogels üzerinde geliştirilmiştir ve sonuçları belirli özelliklerini biomaterial (polyacrylamide) ve değil sadece fiziksel işaret (sertlik) ortaya çıkmış olmasıdır biomaterial. Bu nedenle, hangi-ebilmek var olmak güdümlü sertlik hydrogels polietilenin tarafından hidrojel, başka bir tür geliştirmek önemlidir. Bu amaçla, bioinert hydrogels, polivinil alkol-co-İtakonik asit (P-IA) crosslinking derecesi ile bir değişen crosslinking saat25, tarafından kontrol farklı bir sertlik ile hazırlanmıştır geliştirilmiştir 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. kök hücreleri ekstrasellüler matrisler (ECMs) ve oligopeptides ile aşılı P-IA hydrogels yanı sıra nonmodified P-IA hydrogels ekili. Bir önceki çalışma25içinde insan hematopoetik kök hücreleri (hHSCs) göbek kordon kanı, P-IA hydrogels üzerinde nerede fibronektin veya bir chowing türetilen 30 kPa depolama modülü 3 kPa arasında değişen farklı sertlik değerleri ile ekili fibronektin (CS1, EILDVPST) P-IA hydrogels aşılı. Yüksek ex vivo hHSCs kat genişlemesi CS1 veya 12 kPa 30 kPa-25arasında değişen bir ara sertlik görüntülenen fibronektin ile aşılı P-IA hydrogels gözlendi.
İnsan ES ve IPS hücre ECMs, vitronectin veya onların pluripotency korumak için laminin gibi belirli bağlama gerektirdiği için insan IP ve ES hücreleri geleneksel doku kültürü polistiren (TCP) yemekleri33,34 üzerinde ekili olamaz uzun vadeli kültür sırasında. Bu nedenle, chowing aşılı P-IA hydrogels en iyi sertlik özelliklere sahip olan birkaç yapılar tasarlanmış ve oluşumları tek bir zinciri, tek bir zinciri ile ortak bir segment, bir çift zincir ortak bir kesimi ve dallı türü ile hazırlanan zincir32. Chowing dizileri ECMs integrin ve glikozaminoglikan bağlayıcı etki alanlarından seçildi. Yaklaşık 25 kPa depolama modülü olan vitronectin elde edilen oligopeptides ile bir çift zincir veya ortak segment, aşılı P-IA hydrogels insan ES ve IPS hücreleri uzun vadeli kültür xeno-Alerjik ve kimyasal altında 12 pasajlar için desteklenen tanımlanmış koşulları32. Ortak segment ve hücre adezyon molekülleri hydrogels üzerinde çift zincirle yayılması kolaylaştırdı ve pluripotency insan ES ve IPS32hücreleri. Burada, P-IA hydrogels (ile 10 kPa bir depolama modül için havada ıslak şartlar altında ölçülen 30 kPa) hazırlanması için bir protokol olan ve olmayan oligopeptides aşılı veya ECMs açıklanmıştır. Nasıl kültür ve birkaç kök hücreleri (amniyotik sıvı kök hücre, kök hücre yağ elde edilen, insan ES hücreleri ve insan IP’leri hücreleri dahil) geçiş gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM ve P-IA-ECM hydrogels değişen sertlik ile uzun vadeli genişlemesi insan ES ve IPS hücreleri onların pluripotency xeno-Alerjik koşullar üzerinden pasajlar, yanı sıra insan AFS hücresi, reklamlar hücre kültürünü korumak için geliştirilmiştir, ve hematopoetik kök hücre25,28,32. P-IA hydrogels oligoECM ile immobilize hücre kültür malzeme türleri kök hücreler gibi Primer hücre çoğalması ve …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen grant numaraları’nın altında 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 ve 104-2221-E-008-107-MY3 Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da Tayvan Landseed hastane Projesi (NCU-LSH-105-A-001) tarafından desteklenmiştir. Bilimsel araştırma (sayı 15K 06591) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya için bir Grant-in-Aid da kabul edilmektedir. A. Higuchi lisansüstü çalışmalar ve araştırmalar, Kral Suud Üniversitesi, Riyad 11451, Suudi Arabistan için uluslararası bilimsel ortaklık programı (ISPP-0062) Yardımcısı Rektörlüğü için kabul etmek istiyorum.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Referencias
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
