Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno
Summary
Se presenta un protocolo para preparar polivinilos hidrogeles de ácido itacónico-co-alcohol con rigidez variable, que han sido injertadas con y sin oligopéptidos, para investigar el efecto de la rigidez de los biomateriales en la diferenciación y proliferación de células madre. La rigidez de los hidrogeles fue controlada por el tiempo de reticulación.
Abstract
El efecto de señales físicas, tales como la rigidez de los biomateriales en la proliferación y diferenciación de células madre, ha sido investigado por varios investigadores. Sin embargo, la mayoría de estos investigadores ha utilizado hidrogeles de poliacrilamida para el cultivo de células madre en sus estudios. Por lo tanto, sus resultados son controvertidos porque esos resultados pudieran originar de las características específicas de la poliacrilamida y no de la localización física (rigidez) de los biomateriales. Aquí, describimos un protocolo para la preparación de hidrogeles, que no se basan en poliacrilamida, donde varios vástago y las células incluyendo las células madre embrionarias humanas (ES) humanas pluripotentes inducidas (iPS) células, puede ser cultivado. Se prepararon hidrogeles con rigidez variable del bioinert el ácido itacónico-co-alcohol polivinilo (P-IA), con rigidez controlada por grado de reticulación por cambiar tiempo de reticulación. Investigaron a los hidrogeles de P-IA injertados con y sin oligopéptidos derivados de matriz extracelular como una plataforma de futuro para la cultura de célula de vástago y diferenciación. La cultura y el paso de las células madre del líquido amnióticas, células madre procedentes de adiposo, células madre embrionarias humanas y las células iPS humanas se describe en detalle aquí. Los hidrogeles oligopeptide P-IA demostraron funcionamientos superiores, que fueron inducidas por sus propiedades de rigidez. Este protocolo informa la síntesis del biomaterial, su manipulación superficial, junto con el control de las propiedades de rigidez y, finalmente, su impacto en el destino de la célula de vástago usando las condiciones de cultivo libre de xeno. Basado en estudios recientes, tales sustratos modificados pueden actuar como futuras plataformas para apoyar y dirigir el destino de varias línea de células madre a diferentes vínculos; y además, regenerar y restaurar las funciones de la perdida órgano o tejido.
Introduction
El destino de la diferenciación de la célula de vástago en un linaje específico de células y la proliferación a largo plazo de células madre, células especialmente humanas pluripotentes inducidas (iPS) y las células madre embrionarias humanas (ES), se sabe para ser regulados por inhibidores de factores de crecimiento, y / o pequeñas moléculas bioactivas en medios de cultivo. Recientemente, han sido reconocidas las señales físicas de los biomateriales, particularmente la rigidez de biomateriales de la cultura de célula, a ser un factor importante que guía el destino de la célula de vástago proliferación y diferenciación1,2, 3,4,5,6. Por lo tanto, varios investigadores han comenzado a investigar el destino de las células madre, que se cultivan en hidrogeles, en diferenciación, principalmente utilizando hidrogeles de poliacrilamida con rigidez variable.
La rigidez de los biomateriales puede controlar adherencias focales, morfología celular, fenotipo de la célula y adherencia de la célula de vástago, sobre todo en dos dimensiones (2D) cultivo1,2,3,5. Mecano-detección de biomateriales las células madre generalmente es controlada por adherencia focal señalización vía receptores de integrina. NMMIIA, miosina UROLOGICAL contractilidad IIA dependen del citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en el proceso de mechanosensing de células madre en células de 2-D cultivo sistemas3,4,5, 7,8,9,10,11.
ENGLER y sus colegas desarrollaron un interesante concepto que las células madre adultas, como la médula ósea (BMS) células cultivadas en biomateriales de cultura de célula con una rigidez similar a la de tejidos específicos, tienden a diferenciarse en células que se originaron de tejidos específicos5. Se incubaron las células BMS en hidrogeles de poliacrilamida suave 2-D con colágeno de tipo I (con una rigidez comparable a la de tejidos de cerebro) en medios de expansión espontáneamente fueron inducidos a diferenciarse en linajes tempranos de neurona, mientras que las células BMS cultivan en hidrogeles con una rigidez similar a la del músculo o los tejidos de colágeno del hueso se encontraron para inducir la diferenciación en linajes tempranos de miocitos y osteoblastos, respectivamente, en los hidrogeles de poliacrilamida 2-D3,5. Muchos investigadores han investigado el destino de la célula de vástago de diferenciación cultivadas en poliacrilamida hidrogel inmovilizado con colágeno tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. sin embargo, debe mencionarse que algunos contradictorios informes1,18,22,23,24 existen para la bien conocida idea sugerida por Engler et al. 5 se trata ya idea5 de Engler fue desarrollado exclusivamente en hidrogeles de poliacrilamida y sus resultados han originado de características específicas del biomaterial (poliacrilamida) y no únicamente de la localización física (rigidez) de el biomaterial. Por lo tanto, es importante desarrollar otro tipo de hidrogel, de que la rigidez puede ser controlada por reticulación de los hidrogeles. Para ello, se desarrollaron bioinert hidrogeles, que fueron preparados de ácido itacónico-co-alcohol polivinilo (P-IA) con una rigidez diferente, que estaba controlada por el grado de reticulación con un cambiante reticulación tiempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. las células madre puede ser cultivadas en hidrogeles P-IA nonmodified, como IA P hidrogeles injertados con matrices extracelulares (ECMs) y oligopéptidos. En un estudio anterior25, humanos las células madre hematopoyéticas (hHSCs) de cordón umbilical se cultivaron en P-IA hidrogeles con valores de rigidez diferentes que van desde un 3 kPa a 30 kPa módulo de almacenamiento donde fibronectina o un oligopéptido se deriva de fibronectina (CS1, EILDVPST) fue injertado en los hidrogeles de P-IA. Alto ex vivo doble expansión de hHSCs se observó en los hidrogeles de P-IA injertados con CS1 o fibronectina, que muestra una rigidez intermedia desde 12 kPa hasta 30 kPa25.
IPS humana y células madre embrionarias no pueden cultivarse en cultivo de tejidos convencionales poliestireno (TCP) platos33,34 porque ES humano y las células iPS requieren unión específica a ECMs, como vitronectina laminina mantener su pluripotencia durante el cultivo a largo plazo. Por lo tanto, varias estructuras de hidrogeles de P-IA oligopeptide-injertado con características de rigidez óptimo fueron diseñadas y preparadas en las formaciones de una sola cadena, una sola cadena con una serie de sesiones conjunta, una doble cadena con una serie de sesiones conjunta y un tipo ramificado cadena de32. Oligopeptide secuencias fueron seleccionadas de dominios de unión de la integrina y la glycosaminoglycan de ECMs. Los hidrogeles de P-IA injertados con oligopéptidos derivados de vitronectina con una doble cadena o serie de sesiones conjunta, que tienen un módulo de almacenamiento en aproximadamente 25 kPa, apoya la cultura a largo plazo ES humano y las células iPS para más de 12 pasajes gratis xeno y química condiciones definidas de32. La serie de sesiones conjunta y doble cadena con moléculas de adhesión celular en los hidrogeles facilitan la proliferación y células de pluripotencia de humano ES e iPS32. Aquí, un protocolo para la preparación de hidrogeles P-IA (con un módulo de almacenamiento de 10 kPa a 30 kPa, que se midió bajo condiciones de humedad en el aire) injertadas con y sin oligopéptidos o ECMs se describe. Se muestra cómo la cultura y paso varias células (incluyendo las células madre del líquido amnióticas, células madre procedentes de adiposo, células madre embrionarias humanas y las células iPS humanas).
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM y P-IA-ECM hidrogeles con rigidez variable fueron desarrollados para la expansión a largo plazo de ES humano y las células iPS mantienen su pluripotencialidad para más de diez pasos en condiciones libres de xeno, así como para el cultivo de células humanas de la AFS, células de anuncios, y las células madre hematopoyéticas25,28,32. P-IA hidrogeles inmovilizados con oligoECM son un excelente candidato para l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue parcialmente financiada por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán bajo la beca número 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 y 104-2221-E-008-107-MY3. Esta investigación también fue apoyada por el proyecto de Hospital de Landseed de Taiwán (NCU-LSH-105-A-001). Subvenciones para la investigación científica (número 15K 06591) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón también es reconocido. A. Higuchi agradece a para el programa internacional de colaboración científica (ISPP-0062) Vicerrectorado de estudios de posgrado e investigación, Universidad Rey Saud, Riyadh 11451, Reino de Arabia Saudita.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Referencias
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