Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro
Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.
Abstract
Le pancréas est qu’un organe complexe composé de plusieurs types de cellules différentes qui travaillent ensemble pour réguler la digestion et l’homéostasie du glucose du sang. Ces types de cellules comprennent des cellules acineuses sécrétant des enzymes, un système canalaire arborisé responsable pour le transport des enzymes de l’intestin et productrices de l’hormone des cellules endocrines.
Bêta-cellules endocrines sont le type de cellule unique dans le corps qui produisent l’insuline pour abaisser la glycémie. Le diabète, une maladie caractérisée par une perte ou à la dysfonction des cellules bêta, atteint des proportions épidémiques. Ainsi, il est essentiel d’établir des protocoles afin d’étudier le développement des cellules bêta qui peut être utilisé pour des fins de dépistage pour dériver de la drogue et les thérapies cellulaires. Alors que l’étude expérimentale du développement chez la souris est essentielle, des études in vivo sont laborieux et fastidieux. Les cellules cultivées fournissent une plate-forme plus commode pour le dépistage ; Cependant, ils sont incapables de maintenir la diversité cellulaire, organisation architectonique et interactions cellulaires trouvées in vivo. Ainsi, il est essentiel de développer de nouveaux outils pour étudier la physiologie et l’organogénèse du pancréas.
Les cellules épithéliales du pancréas développent en étroite association avec mésenchyme dès le début de l’organogenèse comme cellules organisent et se différencient en l’organe adulte complexe, physiologiquement compétent. Le mésenchyme pancréatique fournit des signaux importants pour le développement du système endocrinien, dont beaucoup ne sont pas bien compris encore, donc difficile de récapituler au cours de la culture in vitro . Nous décrivons ici un protocole à la culture souris complexes en trois dimensions, cellulaire organoïdes qui conservent le mésenchyme, appelé pancreatoids. Le bourgeon du pancréas murin e10.5 est disséqué, dissocié et cultivé dans un environnement sans échafaudage. Ces cellules de flottants s’auto-assembler avec mésenchyme enveloppant le pancreatoid en développement et quelques robustes de bêta-cellules endocrines, développant ainsi que l’acineuses et les cellules de la gaine. Ce système peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires sort détermination, organisation structurelle et morphogenèse, cellules pendant l’organogenèse, ou pour la drogue, petite molécule ou dépistage génétique.
Introduction
Délimiter les mécanismes du développement normal et la physiologie est primordiale pour comprendre l’étiologie de la maladie et de cultiver en fin de compte les méthodes de traitement. Alors que la mise en culture et la différenciation des cellules souches permettent une analyse rapide et haut débit de développement, il est limité par l’acquis des connaissances sur les mécanismes de régulation sort de la cellule et récapitule artificiellement le développement dans un relativement un État homogène, deux dimensions1,2. Non seulement en vivo développement touché par des influences extrinsèques, avec différents types de cellules dans la niche et le milieu fournit des signaux paracrines et soutien organisationnel pour guider l’organogenèse, mais la fonction de ces cellules s’appuie également sur leur cadre d’orientation3,4,5. Compte tenu de l’importance de ces facteurs externes, les limitations des protocoles de différenciation et la nature laborieuse des modèles de souris in vivo , nouveaux systèmes sont nécessaires pour étudier expérimentalement physiologie et processus de base du développement.
L’émergence des protocoles pour générer organoïdes Three-Dimensional, complexe fournit un système commode et congruent pour étudier l’organogénèse, la physiologie, l’efficacité du médicament et même pathogenèse. Établissement organoïdes murin pour différents systèmes tels que l’ estomac de6 et l’intestin7 ont élargi notre compréhension de l’organogenèse, fournissant un outil pour étudier les complexités du développement avec moins de restrictions que en vivo et les modèles in vitro . En raison de ces avancées dans la murine organoïde formation et l’avènement de pluripotentes humaines découlent cellules, intestinale humaine8, rétinienne9, rénale10,11, et cérébral12 organoïdes ont été produites et ce Répertoire est seulement limitée par les connaissances actuelles concernant les mécanismes de développement.
Un intérêt particulier est la génération de pancréatique organoïdes, comme les types différents de cellules pancréatiques, y compris les cellules acineuses et conduits à l’insuffisance pancréatique exocrine13, cellules acineuses dans la pancréatite14, sévit dans une multitude de maladies et cellules bêta dans le diabète15. Acquérir des connaissances concernant l’évolution de ces différents types de cellules puisse aider à comprendre leur pathologie et peut, aussi, servir de plate-forme pour le dépistage des drogues personnalisée ou de la transplantation. Auparavant, Greggio et coll. a développé une méthode pour créer des murins organoïdes pancréatique récapituler en vivo morphogenèse et de développer des structures organisées, en trois dimensions, complexes composés de toutes les principales cellules épithéliales du pancréas types de16,17. Il s’agit d’une avancée majeure dans le domaine du pancréas, surtout en faisant des cellules in vitro pouvez activer investigation biologique du développement des cellules bêta. Toutefois, la rareté des cellules endocrines formé dans le présent protocole à moins que les organoids ont été transplantés dans les tissus, où la niche pourrait interagir et fournir des repères pédagogiques17. Le mésenchyme constitue la plus grande partie de la niche, très enveloppant l’épithélium en développement depuis le début de l’organogenèse aux stades ultérieurs, y compris la délamination endocrinienne et différenciation3,4, 18. L’interaction entre le mésenchyme et le pancréas en développement est encore un autre exemple de signalisation extrinsèque et l’importance de maintenir in vivo la complexité cellulaires pour étudier l’organogenèse.
Nous décrivons ici comment générer en trois dimensions organoïdes pancréatique, appelé pancreatoids, de e10.5 dissociées des progéniteurs pancréatique murine. Ces pancreatoids conserver mésenchyme natif, s’auto-assembler en conditions flottantes et générer tous les types de grandes cellules pancréatiques, dont quelques cellules endocrines de beta19robuste. Cette approche est plus adaptée pour l’analyse du développement endocrinien, comme les protocoles précédents n’ont pas la différenciation endocrine robuste. Cependant, en utilisant le protocole pour organoïdes pancréatique tel que décrit par Greggio et coll. est mieux adapté pour l’analyse de ramification épithéliales du pancréas et de la morphogenèse, comme ramification est plus limitée en pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progression des modèles de culture de cellules est essentielle à l’élaboration d’un modèle correctement, produisent des types de cellules cliniquement pertinents, test de l’efficacité du médicament ou même greffe à des patients. Cependant, récapitulant artificiellement le développement dans un plat est difficile car nous sommes encore loin de comprendre les mécanismes de l’organogénèse et de la physiologie in vivo. In vitro les cellules sont donc générés de façon inefficace, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jolanta Chmielowiec pour toute question utile concernant le protocole et le manuscrit. Nous remercions également Benjamin Arenkiel d’accès au microscope confocal. Ce travail a été soutenu par les NIH (P30-DK079638 à M.B.) et T32HL092332-13 au M.A.S. et M.B., la Fondation médicale McNair (à M.B.) et le noyau confocal au BCM intellectuelle et Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referencias
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