Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.
Abstract
O pâncreas é que um órgão complexo composto de muitos tipos de células diferentes que trabalham juntos para regular a digestão e homeostase de glicose do sangue. Estes tipos de células incluem células acinares secretoras de enzima, um sistema ductal arborized responsável para o transporte de enzimas para as intestino e produção de hormônio de células endócrinas.
Beta-células endócrinas são o tipo de célula única no organismo que produzem a insulina para baixar os níveis de glicose do sangue. Diabetes, uma doença caracterizada por uma perda ou a disfunção das células beta, está alcançando proporções epidêmicas. Assim, é essencial estabelecer protocolos para investigar o desenvolvimento de células beta que pode ser usado para fins de triagem para derivar a droga e a terapêutica baseada em célula. Enquanto a investigação experimental do desenvolvimento do mouse é essencial, na vivo estudos são trabalhosas e demoradas. Células cultivadas fornecem uma plataforma mais conveniente para a seleção; no entanto, eles são incapazes de manter a diversidade celular, organização arquitetônica e interacções celulares encontradas in vivo. Assim, é essencial para desenvolver novas ferramentas para investigar fisiologia e organogênese no pâncreas.
Células epiteliais pancreáticas desenvolveram em estreita associação com mesênquima desde o início da organogênese como células organizam e diferenciarem-se em órgão complexo, fisiologicamente competente adulto. A mesênquima pancreática fornece sinais importantes para o desenvolvimento do sistema endócrino, muitos dos quais não são bem compreendidos ainda, assim, difícil recapitular durante o cultivo em vitro . Aqui, descrevemos um protocolo para organoids de rato complexas tridimensionais, celular de cultura que retêm mesênquima, denominada pancreatoids. O broto pancreático murino de e10.5 é dissecado, dissociado e cultivado em um ambiente livre de andaime. Estas células de flutuação auto-montagem com mesênquima que envolvia o desenvolvimento pancreatoid e um número robusto de beta-células endócrinas, desenvolvendo juntamente com o acinares e as células do duto. Este sistema pode ser usado para estudar as interações de célula célula célula destino determinação, organização estrutural e morfogênese, durante a organogênese, ou para a droga, pequena molécula ou rastreio genético.
Introduction
Delinear os mecanismos do desenvolvimento normal e a fisiologia é fundamental para compreender a etiologia da doença e, finalmente, cultivar métodos de tratamento. Enquanto cultivo e diferenciação de células-tronco permite uma análise rápida e de alta produtividade de desenvolvimento, é limitada pelo corpo de conhecimentos sobre os mecanismos que regulam o destino de célula existente e artificialmente recapitula o desenvolvimento em um relativamente Estado homogêneo, bidimensional1,2. Não só está na vivo desenvolvimento afetado por influências extrínsecas, com diferentes tipos de células no nicho e meio fornecendo sinais parácrina e apoio organizacional para guiar a organogênese, mas a função destas células também se baseia em sua ambiente para orientação3,4,5. Dada a importância desses sinais externos, as limitações de protocolos de diferenciação e a natureza laboriosa de modelos de rato na vivo , novos sistemas são necessários para investigar experimentalmente fisiologia e processos básicos do desenvolvimento.
O surgimento de protocolos para gerar tridimensionais, complexo organoids fornece um sistema conveniente e congruente para estudar organogênese, fisiologia, eficácia de drogas e até mesmo patogênese. Que estabelece organoids murino para diferentes sistemas tais como o estômago6 e intestino7 expandimos nossa compreensão da organogênese, fornecendo uma ferramenta para estudar as complexidades do desenvolvimento com menos restrições do que in vivo e modelos em vitro . Devido a estes avanços nos organoides murino-formação e o advento de pluripotentes humanas tronco células intestinais humanas8, retina9, renal10,11, e organoids cerebral12 foram produzidos e isto repertório é limitado pelo conhecimento existente sobre mecanismos de desenvolvimento.
De particular interesse é a geração de organoids do pâncreas, como pragas de uma miríade de doenças diferentes pancreático tipos de células, incluindo células acinares e dutos em insuficiência pancreática exócrina13, células acinares em pancreatite14, e células beta em diabetes15. Adquirir conhecimentos sobre o desenvolvimento destes tipos de células diferentes poderia auxiliar na compreensão de sua patologia e, também, agir como uma plataforma para triagem de drogas personalizadas ou transplante. Anteriormente, et al . Greggio desenvolveu um método para criar murino organoids pancreático que recapitular na vivo morfogênese e desenvolver estruturas organizadas, tridimensionais, complexas compostas por todas as grandes células epiteliais do pâncreas tipos de16,17. Este é um grande passo em frente no campo do pâncreas, especialmente como fazer células in vitro pode habilite investigação biológica do desenvolvimento de células beta. No entanto, uma escassez de células endócrinas formada neste protocolo, a menos que os organoids foram transplantadas no tecido, onde o nicho poderia interagir e fornecer pistas instrucional17. A mesênquima constitui a maior parte do nicho, envolvendo fortemente o epitélio em desenvolvimento desde as fases iniciais da organogênese para fases posteriores, incluindo delaminação endócrino e diferenciação3,4, 18. A interação entre a mesênquima o pâncreas em desenvolvimento é mais um exemplo de sinalização extrínseca e a importância da manutenção na vivo celular complexidade estudar organogênese.
Aqui, descrevemos como gerar tridimensional organoids do pâncreas, denominado pancreatoids, de e10.5 dissociada murino progenitoras pancreáticas. Estes pancreatoids reter mesênquima nativa, auto-montagem em condições de livre flutuação e gerar todos os tipos de grandes células pancreáticas, incluindo um número robusto de células endócrinas beta19. Esta abordagem é mais adequada para a análise do desenvolvimento do sistema endócrino, como protocolos anteriores faltam robusta diferenciação endócrina. No entanto, usando o protocolo para organoids do pâncreas como descrito por Greggio et al é mais adequado para análise de ramificação epiteliais do pâncreas e morfogênese, como ramificação é mais limitada em pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
A progressão dos modelos de cultura de células é fundamental para corretamente o desenvolvimento de modelos, produzir tipos de células clinicamente relevantes, teste de eficácia de drogas ou até mesmo transplante para pacientes. No entanto, artificialmente recapitulando o desenvolvimento em um prato é um desafio que estamos ainda longe de compreender os mecanismos da organogênese e fisiologia in vivo. Assim, em vitro células são ineficientemente gerado, não totalmente funcional, incapaz de se…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discussão sobre o protocolo e o manuscrito. Agradecemos também Benjamin Arenkiel para acesso ao microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pelo NIH (P30-DK079638 para M.B.) e T32HL092332-13-M.A.S e M.B., Fundação médica McNair (para M.B.) e o núcleo confocal no BCM intelectual e inabilidades desenvolventes Research Center (NIH U54 HD083092 da Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional da criança saúde e desenvolvimento humano).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referencias
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