Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.
Abstract
Il pancreas è che un organo complesso composto di molti diversi tipi di cellule che lavorano insieme per regolare la digestione e l’omeostasi del glucosio di anima. Questi tipi di cellule includono enzima-secrezione delle cellule acinose, un sistema duttale arborized responsabile del trasporto degli enzimi per le cellule endocrine dell’intestino e producono ormoni.
Beta-cellule endocrine sono il tipo di suola delle cellule nel corpo che producono l’insulina per abbassare i livelli di glucosio nel sangue. Diabete, una malattia caratterizzata da una perdita o la disfunzione delle cellule beta, sta raggiungendo proporzioni epidemiche. Quindi, è essenziale stabilire protocolli per studiare lo sviluppo della beta-cellula che può essere utilizzato ai fini dello screening per derivare la droga e le terapie basate su cellule. Mentre l’indagine sperimentale del mouse sviluppo è essenziale, in vivo gli studi sono laboriosa e che richiede tempo. Cellule coltivate forniscono una piattaforma più conveniente per lo screening; Tuttavia, essi sono in grado di mantenere la diversità cellulare, organizzazione architettonica e interazioni cellulari trovati in vivo. Quindi, è essenziale per sviluppare nuovi strumenti per studiare la fisiologia e l’organogenesi pancreatica.
Cellule epiteliali pancreatiche si sviluppano in stretta associazione con mesenchima fin dall’inizio dell’organogenesi come cellule organizzano e si differenziano nell’organo adulto complesso, fisiologicamente competente. Il mesenchima pancreatico fornisce segnali importanti per lo sviluppo del sistema endocrino, molti dei quali non sono buono capiti ancora, così difficile ricapitolare durante la coltura in vitro . Qui, descriviamo un protocollo alla cultura del mouse complesso tridimensionale, cellulare organoids che conservano mesenchima, chiamato pancreatoids. Il germoglio pancreatico murino e 10.5 è sezionato, dissociato e coltivato in un ambiente senza impalcatura. Questi galleggianti cellule assemblarsi con mesenchima avvolgente il pancreatoid in via di sviluppo e un robusto numero delle beta-cellule endocrine, sviluppando insieme l’acinose e cellule del condotto. Questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni cellula-cellula cellula determinazione di destino, organizzazione strutturale e morfogenesi, durante l’organogenesi, o per la droga, piccola molecola o screening genetico.
Introduction
Delineare i meccanismi dello sviluppo normale e la fisiologia è fondamentale per capire l’eziologia di malattia e coltivare in ultima analisi, metodi di trattamento. Mentre la coltura e la differenziazione delle cellule staminali permette analisi di alto-rendimento e veloce di sviluppo, è limitata dal corpo esistente di conoscenza dei meccanismi che regolano il destino delle cellule e artificialmente ricapitola lo sviluppo in un relativamente omogenea, bidimensionale stato1,2. Non solo è in vivo sviluppo influenzato dai fattori estrinseci, con diversi tipi di cellule nella nicchia e milieu fornendo segnali paracrini e supporto organizzativo per guidare l’organogenesi, ma la funzione di queste cellule si basa anche sulla loro dintorni per orientamento3,4,5. Dato l’importanza di queste indicazioni esterne, le limitazioni dei protocolli di differenziazione e la natura laboriosa di in vivo modelli murini, nuovi sistemi sono necessari studiare sperimentalmente fisiologia e processi di base inerente allo sviluppo.
L’emersione dei protocolli per generare organoids tridimensionale, complesso fornisce un sistema conveniente e congruo per studiare l’organogenesi, la fisiologia, l’efficacia dei farmaci e anche patogenesi. Che istituisce organoids murino per diversi sistemi come lo stomaco6 e intestino7 hanno ampliato la nostra comprensione dell’organogenesi, fornendo uno strumento per studiare la complessità inerente allo sviluppo con meno restrizioni rispetto a vivo e modelli in vitro . A causa di questi avanzamenti nella murino organoid formazione e l’avvento di pluripotenti umane derivano cellule, intestinale umano8, retinica9, renale10,11, e cerebrale12 organoids sono state prodotte e questo repertorio è limitato solo dalla conoscenza esistente per quanto riguarda i meccanismi di sviluppo.
Di particolare interesse è la generazione dei organoids del pancreas, come una miriade di malattie affligge tipi differenti delle cellule del pancreas, compreso le cellule acinose e condotti in insufficienza pancreatica exocrine13, cellule acinose in pancreatite14, e cellule beta nel diabete15. Acquisire conoscenze relative allo sviluppo di questi tipi differenti delle cellule potrebbe aiutare a comprendere la loro patologia e può, inoltre, agire come una piattaforma per lo screening di stupefacenti personalizzati o trapianto. In precedenza, Greggio et al ha sviluppato un metodo per creare organoids pancreatico murino che ricapitolare in vivo morfogenesi e sviluppare strutture organizzate, tridimensionale, complesse composte da tutti i principali delle cellule epiteliali del pancreas tipi di16,17. Si tratta di un importante passo avanti nel campo del pancreas, soprattutto come fare le cellule in vitro possibile attivare indagini biologiche dello sviluppo della cellula beta. Tuttavia, una scarsità di cellule endocrine formata in questo protocollo, a meno che il organoids sono stati trapiantati in tessuto, dove la nicchia potrebbe interagire e fornire spunti didattici17. Il mesenchima costituisce la più grande parte della nicchia, pesantemente avvolgente dell’epitelio in via di sviluppo dalle fasi iniziali dell’organogenesi a fasi successive, tra cui endocrino delaminazione e differenziazione3,4, 18. L’interazione del mesenchyme con il pancreas in via di sviluppo è l’ennesimo esempio di segnalazione estrinseca e l’importanza di mantenere in vivo cellulare complessità per studiare l’organogenesi.
Qui, descriviamo come generare tridimensionale organoids pancreatico, chiamato pancreatoids, da progenitori pancreatico murino dissociate e 10.5. Questi pancreatoids conservare mesenchima nativo, auto-assemblarsi in condizioni di libero di fluttuare e generare tutti i tipi principali delle cellule del pancreas, compreso un robusto numero di cellule endocrine beta19. Questo approccio è più adatto per l’analisi dello sviluppo endocrino, come protocolli precedenti mancano robusta differenziazione endocrina. Tuttavia, utilizzando il protocollo per organoids pancreatico come descritto da Greggio et al è più adatto per analisi di ramificazione epiteliale del pancreas e morfogenesi, come ramificazione è più limitato a pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progressione dei modelli della coltura cellulare è fondamentale per correttamente modello sviluppo, produrre tipi cellulari clinicamente rilevanti, prova l’efficacia dei farmaci o trapianto anche ai pazienti. Tuttavia, artificialmente ricapitola lo sviluppo in un piatto è impegnativo come siamo ancora lontani dal comprendere i meccanismi della organogenesi e fisiologia in vivo. Così le cellule in vitro sono inefficacemente generato, non completamente funzionale, incapace di essere mantenuti per lu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jolanta Chmielowiec vi ringraziamo utile discussione per quanto riguarda il protocollo e il manoscritto. Ringraziamo anche Benjamin Arenkiel per l’accesso al microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da NIH (P30-DK079638 a M.B.) e T32HL092332-13-m.a.s. e M.B., il fondamento medico di McNair (a M.B.) e il nucleo confocale al BCM intellettuale e centro di ricerca di inabilità inerenti allo sviluppo (NIH U54 HD083092 dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referencias
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