نموذج في المختبر لدراسة أثر "العلاج الضوئي" 5-Aminolevulinic حمض-بوساطة على بيوفيلم العنقوديات الذهبية
Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لدراسة تأثير مضادات الميكروبات 5-aminolevulinic حمض بوساطة العلاج الضوئي (علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي) في بيوفيلم العنقوديات الذهبية . يمكن استخدام هذا البروتوكول لتطوير نموذج في المختبر لدراسة علاج الأغشية الحيوية البكتيرية مع التوقيت الصيفي الباسفيكي في المستقبل.
Abstract
المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) من مسببات الأمراض بشرية مشتركة، الذي يسبب التهابات قيحية والجهازية. عدوى المكوّرات س يصعب القضاء عليه ليس فقط بسبب ظهور سلالات مقاومة للمضادات الحيوية ولكن أيضا قدرتها على شكل الأغشية الحيوية. وقد أشير مؤخرا، العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) كواحد من العلاجات المحتملة للسيطرة على العدوى بيوفيلم. ومع ذلك، كذلك الدراسات مطلوبة لتحسين معرفتنا بتأثيرها على الأغشية الحيوية البكتيرية، فضلا عن الآليات الكامنة. ويصف هذه المخطوطة نموذجا في المختبر للتوقيت الصيفي الباسفيكي مع 5-aminolevulinic حمض (5-علاء)، تمهيدا محسس ضيائي الفعلية، بروتوبورفيرين التاسع (بي). بإيجاز، ناضجة في المذهبة س. الأغشية الحيوية المحتضنة مع علاء وثم عرضه للضوء. في وقت لاحق، أثر مضاد علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في المذهبة س. بيوفيلم كمياً عن طريق حساب مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) وتصور بجدوى الفلورسنت تلطيخ عبر الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (كلسم). وأظهرت نتائج تمثيلية تأثير مضاد قوي لعلاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في المذهبة س. الأغشية الحيوية. هذا البروتوكول هو بسيط ويمكن استخدامها لوضع نموذج في المختبر لدراسة علاج الأغشية الحيوية في المذهبة س. مع علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي. في المستقبل، أنها أيضا يمكن أن تكون مرجعاً في التوقيت الصيفي الباسفيكي دراسات استخدام الضيائية الأخرى للسلالات البكتيرية المختلفة مع الحد الأدنى من التعديلات.
Introduction
س المذهبة من مسببات المرض إيجابية هامة كولونيزيس الجلد والغشاء المخاطي للمضيفين البشرية. قدرته على شكل الأغشية الحيوية يعتبر جانبا هاما في نشوء المرض1. الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجتمع بكتيريا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة منتجة ذاتيا، وهي تتألف من المواد البوليمرية خارج الخلية، بما في ذلك السكاريد والحمض النووي والبروتين. هذه المصفوفة يلعب دوراً هاما في استمرار وجود العدوى البكتيرية، تسهم بدرجة عالية من المقاومة للجهاز المناعي البشري و العلاجات المضادة للميكروبات الحالي2. المضادات الحيوية لا تزال الرئيسية علاج التهابات بيوفيلم، على الرغم من أن تقتصر آثار المضادات الحيوية في الأغشية الحيوية. لقد ثبت سابقا أن خلايا الأغشية الحيوية 10-000 1 مرة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية مقارنة نظرائهم العوالق3. وبالتالي، هناك حاجة إلى استراتيجيات بديلة للتغلب على هذه المشكلة.
التوقيت الصيفي الباسفيكي، علاج بديل للعدوى البكتيرية، يستخدم الضوء طول موجي مناسب لتنشيط الضيائية. وهذا يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، التي قاتلة للخلايا المستهدفة بتعطيل جدار الخلية ويخمد الإنزيمات وإتلاف الحمض النووي4. وهذه الخاصية متعدد الأهداف يجعل من الصعب على البكتيريا تطوير مقاومة للعلاج التوقيت الصيفي الباسفيكي.
ودرست تأثير مضادات الميكروبات للتوقيت الصيفي الباسفيكي في الأغشية الحيوية البكتيرية والفطرية، مع الضيائية متعددة، مثل أزرق تولويدين، الملكيت الأخضر والأزرق الميثيلين، e6 الكلور والبورفيرنيات، في التقارير السابقة5،6، 7،،من89،10،11،،من1213. 5-علاء، تتميز prodrug من محسس ضيائي الفعلية، بي، بالوزن الجزيئي صغير والتخليص السريع12،14. تعطي هذه المزايا المحتملة الرئيسية علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي كتطبيق العلاج. على الرغم من أن قد درست أثر علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي على البكتيريا العوالق العديد من مجموعات12، أثر الميكروبات علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في الأغشية الحيوية البكتيرية قد لا بعد تم توضيحها. وفي الوقت نفسه، من الصعب مقارنة النتائج بين الدراسات السابقة. أحد الأسباب هو أن البروتوكولات المختلفة المستخدمة من الجماعات المتنوعة. وهكذا يصف هذا البروتوكول نموذجي في المختبر نظام علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي استناداً إلى أن العمل السابق15. وأكد أثر هذا النموذج حساب زيمبابوي واستمرارية تلطيخ مع كلسم.
Protocol
Representative Results
Discussion
التوقيت الصيفي الباسفيكي تم علاج مدروسة لعلاج السرطان منذ اخترع قبل أكثر من 100 سنة18. على مدى العقد الماضي، التوقيت الصيفي الباسفيكي طبق كاستراتيجية مضادة للميكروبات وقد أظهرت فعالية ضد بعض البكتيريا المسببة للأمراض المقاومة للمضادات الحيوية12. بالمقارنة مع الدو…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل “مؤسسة الصين للعلوم الطبيعة الوطنية” للعلماء الشباب (رقم 81300810)، وبرنامج تدريب طبيب الشباب شانغهاي (رقم 20141057)، والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81671982 و 81271791 و 81571955). نود أن نشكر ليتبوب (www.letpub.com) لتقديم المساعدة اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Referencias
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D’Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O’Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
