Un modèle In Vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique véhiculée par 5-Acide aminolévulinique sur Staphylococcus aureus Biofilm
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole afin d’étudier l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus . Ce protocole peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms bactériens par PDT à l’avenir.
Abstract
Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) est un pathogène humain commun, ce qui provoque des infections pyogènes et systémiques. Infections à S. aureus sont difficiles à éliminer non seulement en raison de l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, mais aussi sa capacité à forme biofilms. Récemment, la thérapie photodynamique (TPD) a été indiquée comme l’un des traitements possibles pour contrôler les infections du biofilm. Cependant, plus amples études sont nécessaires pour améliorer notre ignorance de son effet sur les biofilms bactériens, ainsi que les mécanismes sous-jacents. Ce manuscrit décrit un modèle in vitro de PDT avec de l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), un précurseur de la réelle photosensibilisateur, protoporphyrine IX (PpIX). Brièvement, mature S. aureus biofilms ont été incubées avec ALA et ensuite exposées à la lumière. Par la suite, l’effet antibactérien de ALA-PDT sur S. aureus biofilm a été quantifié en calculant les colonies formant des unités (UFC) et visualisée par viabilité fluorescente coloration via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Résultats représentatifs ont démontré une forte action antibactérienne de l’ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus . Ce protocole est simple et peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms de S. aureus par ALA-PDT. À l’avenir, il pourrait également être référencée dans d’études PDT utilisant autres photosensibilisateurs pour différentes souches bactériennes avec des ajustements minimes.
Introduction
S. aureus est un pathogène Gram positif important qui colonise la peau et les muqueuses des hôtes humains. Sa capacité à forme biofilms est considéré comme un aspect important de sa pathogénie1. Biofilms bactériens sont une communauté de bactéries noyées dans une matrice autoproduite, qui est composée de substances polymériques extracellulaires, y compris les polysaccharides, ADN et des protéines. Cette matrice joue un rôle important dans la persistance des infections bactériennes, contribuant à un haut degré de résistance au système immunitaire humain et thérapies anti-microbiens actuels2. Les antibiotiques sont toujours le traitement majeur pour les infections de biofilm, bien que les effets des antibiotiques sur les biofilms sont limitées. Il a été démontré précédemment que les cellules dans les biofilms sont 10 à 1 000 fois plus résistantes aux antibiotiques par rapport à leurs homologues planctoniques3. Ainsi, les stratégies alternatives sont nécessaires à la conquête de ce sujet.
PDT, un autre traitement pour les infections bactériennes, utilise la lumière d’une longueur d’onde appropriée pour activer les substances photosensibilisantes. Cela conduit à la production d’espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont mortelles pour cibler les cellules en perturbant la paroi cellulaire, inactivation des enzymes et endommager l’ADN4. Cette caractéristique de cible multiples, il est difficile pour les bactéries à développer une résistance au traitement PDT.
L’effet antimicrobien du PDT sur les biofilms bactériens et fongiques, avec plusieurs substances photosensibilisantes, comme le bleu de toluidine, vert de malachite, bleu de méthylène, chlore e6 et porphyrines, a été étudiée dans les précédents rapports5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, une prodrogue de la réelle photosensibilisateur, PpIX, se caractérise par son faible poids moléculaire et une clairance rapide12,14. Ces avantages donnent ALA-PDT potentiel majeur comme une application thérapeutique. Bien que l’effet de ALA-PDT sur bactéries planctoniques a été étudiée par de nombreux groupes12, l’effet antimicrobien des ALA-PDT sur les biofilms bactériens n’a pas encore été élucidé. Pendant ce temps, il est difficile de comparer les résultats entre les études antérieures. Une des raisons est que les différents protocoles sont utilisés par divers groupes. Par conséquent, ce protocole décrit un modèle in vitro d’un système de ALA-PDT basé sur notre précédent travail15. L’effet de ce modèle a été confirmée par le calcul de l’UFC et de la viabilité de coloration avec CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT est un traitement bien étudié pour le traitement du cancer depuis il a été inventé il y a plus de 100 ans18. Durant la dernière décennie, PDT a été appliqué comme stratégie d’antimicrobiens et a montré l’efficacité contre certaines bactéries pathogènes résistants aux antibiotiques12. Par rapport à l’État planctonique, biofilms bactériens semblent être plus résistants aux traitements antibiotiques3, tandis que l’effet …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondation des sciences de Nature nationale de Chine pour jeunes chercheurs (no 81300810), programme de formation de Shanghai Young médecin (n° 20141057) et Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81671982, 81271791 et 81571955). Nous tenons à remercier LetPub (www.letpub.com) d’assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Referencias
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