黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル
Summary
本稿では、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの 5-アミノレブリン酸による光線力学療法 (アラ-PDT) の抗菌効果を研究するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、PDT を細菌バイオ フィルムの処理は、将来的に研究する生体外モデルを開発する使用ことができます。
Abstract
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、化膿性および全身感染症を引き起こす一般的なひと病原体です。黄色ブドウ球菌感染症は、抗生物質耐性菌の出現だけでなく、バイオ フィルム フォームする能力だけではなくを根絶することは困難。最近では、光線力学療法 (PDT) は、バイオ フィルム感染症を制御するための潜在的な治療の一つとされています。しかし、さらに研究は根本的なメカニズムと同様、細菌バイオ フィルムへの影響に関する我々 の知識を向上させる必要があります。本稿では、実際の光線、プロトポルフィリン IX (PpIX) の前駆体 5-アミノレブリン酸 (ALA) と PDT のin vitroモデルについて説明します。簡単に言えば、成熟した黄色ブドウ球菌バイオ フィルムは ALA に培養され、光にさらされます。その後、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに対する翼-PDT の抗菌効果はコロニー形成単位 (CFUs) を計算することによって定量化され生存率共焦点レーザーのスキャン顕微鏡検査 (CLSM) を介して染色蛍光で可視化しました。代表の結果は、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに対する翼-PDT の強力な抗菌効果を示した。このプロトコルは簡単、ALA PDT と黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの治療を研究する生体外モデルを開発に使用できます。将来は、最小限の調整で異なる菌株の他の光増感剤を用いた PDT 研究でまた参照することができます。
Introduction
黄色ブドウ球菌は、皮膚と粘膜の人間のホストの定着グラム陽性の病原体が重要です。バイオ フィルム フォームする能力は、その病因1の重要な側面と見なされます。細菌バイオ フィルムは、細菌の細胞外高分子物質、多糖類、DNA、タンパク質などから構成される自主制作のマトリックスに埋め込まれたコミュニティです。この行列は、細菌感染症、人間の免疫システムと現在の抗菌療法2への抵抗の高度に貢献する永続化に重要な役割を果たしています。抗生物質が、バイオ フィルム感染症の主な治療バイオ フィルムに対する抗生物質の効果は限られているが。それは、バイオ細胞は 10-1,000 倍以上の浮遊性対応3に比べて抗生物質に耐性を以前示されています。したがって、この問題を征服するための代替戦略が必要です。
細菌感染症のための代替治療、PDT は、光増感剤を有効にするのに適切な波長の光を使用します。これは、細胞壁を破壊し酵素を不活性化、損傷 DNA4標的細胞致死活性酸素種 (ROS) の生産に します。このマルチ ターゲット特性 PDT 治療への抵抗を開発する細菌の困難になります。
トルイジン ブルーなど、複数の光増感剤で、細菌や真菌性バイオ フィルム、マラカイト グリーン、メチレン ブルー、塩素 e6、ポルフィリンの PDT の抗菌効果は、以前レポート5,6、検討されています 7,8,9,10、11,12,13。5-ALA の実際の光増感剤 PpIX、プロドラッグは、その分子量が小さいと迅速なクリアランス12,14が特徴です。これらの利点は、治療への応用としてアラ-PDT の主要な潜在性を与えます。浮遊性細菌に及ぼす翼-PDT は、多くのグループ12によって研究されているがその細菌バイオ フィルムの翼-PDT の抗菌効果はまだ解明されていません。一方、先行研究の結果を比較することは困難です。理由の 1 つは、多様なグループが使用する別のプロトコルです。したがって、このプロトコルは、私たち以前の作業15に基づく翼-PDT システムの生体外モデルをについて説明します。CFU 計算と CLSM で染色性がこのモデルの効果を確認しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT 以来よく研究療法がんの治療のためには 100 年以上も前に発明されました18。最後のディケイドでは、PDT は抗菌戦略として適用されているし、12いくつかの抗生物質耐性細菌に対して効果を示しています。浮遊性の状態と比較して、細菌バイオ フィルムはバイオ フィルムに及ぼす翼-PDT がされて完全にまだ調査されていない中3抗生物質…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、若手研究者 (第 81300810)、上海の若い医師研修 (第 20141057)、国家自然科学基金、中国の (81671982、81271791、81571955) に中国の国家自然科学基金によって賄われていた。我々 はこの原稿の準備の間に言語の援助を提供するため LetPub (www.letpub.com) に感謝を思います。
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Referencias
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D’Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O’Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
