Nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico nel cuore di Zebrafish adulto
Summary
Rimane una grande sfida di sviluppare condizionale gene knock-out o efficace gene-atterramento in organi di zebrafish adulto. Qui segnaliamo un protocollo per la performante siRNA nanoparticella-mediata silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish, fornendo così un nuovo metodo di perdita di funzione per lo studio di organi adulti in zebrafish e altri organismi di modello.
Abstract
I mammiferi hanno una capacità molto limitata per rigenerare il cuore dopo infarto miocardico. D’altra parte, l’adulto zebrafish rigenera il suo cuore dopo resezione dell’apice o cryoinjury, che lo rende un importante organismo modello per lo studio di rigenerazione del cuore. Tuttavia, la mancanza di metodi di perdita-de-funzione per organi adulti ha limitato comprensioni nei meccanismi di rigenerazione del cuore. Interferenza del RNA tramite diversi sistemi di consegna è un potente strumento per il silenziamento di geni in cellule di mammiferi e organismi modello. Precedentemente abbiamo riferito che nanoparticelle siRNA-incapsulato correttamente entrano nelle cellule e provocare un atterramento di gene-specific del notevole nel cuore adulto zebrafish rigenerante. Qui, presentiamo un protocollo semplice, rapido ed efficiente per la consegna di siRNA Dendrimero-mediata e silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish rigenerante. Questo metodo fornisce un approccio alternativo per determinare le funzioni del gene in organi adulti in zebrafish e può essere esteso ad altri organismi di modello pure.
Introduction
L’infarto miocardico è diventato una minaccia per la salute più importanti, che conduce a un enorme onere economico intorno al mondo1. Il cuore di un mammifero adulto non riesce a rigenerare e ricostituire i cardiomiociti persi su scala macroscopica dopo la ferita, che porta alla formazione di tessuti cicatriziali e conseguente insufficienza cardiaca. A differenza dei mammiferi, il pesce zebra è in grado di rigenerazione del cuore, principalmente attraverso la robusta proliferazione del miocardio dopo diversi tipi di lesione del cuore, rendendolo un organismo modello ideale per indagare i meccanismi molecolari della rigenerazione del cuore 2,3,4,5,6,7,8. Decifrare i meccanismi endogeni sottostante rigenerazione di cuore di zebrafish è un campo di ricerca nella ricerca di nuove strategie terapeutiche migliorare il cuore umano rigenerazione9emozionante.
Metodi di manipolazione genetica sono disponibili in zebrafish. Questi consistono di morpholinos (MO) che sono anche ampiamente utilizzati in rane, pulcino e mammiferi oltre in zebrafish10,11,12,13. MO ha efficiente atterramento di espressione genica in zebrafish adulto pinna, cervello e retina14,15,16,17,18,19. Acido nucleico bloccato (LNA) è un altro oligonucleotide artificiale utilizzato per abbattere l’espressione genica endogena non solo negli embrioni di zebrafish, ma anche in organi di animali adulti20,21,22, 23 , 24. Tuttavia, la mancanza di metodi efficaci di perdita di funzione per i cuori degli adulti rimane un ostacolo nello studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione dell’organo. Al presenti, piccole molecole inibitori o transgenici espressione dei mutanti dominanti negativi vengono utilizzate principalmente per bloccare la funzione di un gene o una via per studiare la sua funzione nel cuore adulto zebrafish rigenerazione25,26 ,27. Tuttavia, non tutti i geni o vie di segnalazione sono applicabili per questi metodi.
Small-interfering RNAs (siRNAs) sono ampiamente usati per l’analisi di perdita-de-funzione di cellule di mammiferi ed embrioni di organismi modello, nonché organi adulti per studi preclinici in animale modelli28,29,30 , 31 , 32. siRNAs sono stati usati efficacemente per silenziare i geni nei tumori33,34,35 e in cardiomiociti36,37,38,39 ,40 tramite diversi sistemi di consegna. Recentemente, abbiamo sviluppato efficiente siRNA-incapsulato nanoparticella silenziamento genico nel cuore adulto rigenerante utilizzando diversi diversi nanoparticelle41,42,43, fornendo un nuovo strumento per studi funzionali dei geni negli organi di zebrafish adulto. Basato su nostri precedenti studi41,42,43, qui vi presentiamo un protocollo semplice, pratico, ma potente per siRNA silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish rigenerante utilizzando f-PAMAM-PEG-R9 dendrimeri. Aldh1a2 (aldeide deidrogenasi 1, membro della famiglia A2) gene era sovraregolati dopo resezione dell’apice di zebrafish e ablazione di Aldh1a2 bloccato la rigenerazione cardiaca44. Qui prendiamo aldh1a2 gene come esempio per testare l’efficienza di atterramento genica mediata da siRNA nanoparticella-incapsulato iniezione. Questo protocollo è contenuta una procedura per resezione del cuore di zebrafish, sintesi chimica delle nanoparticelle e un metodo di consegna su nanoparticelle siRNA-incapsulato nel cuore di zebrafish adulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish è pienamente in grado di rigenerare una varietà di organi compreso il cuore adulto5. Mentre i metodi genetici e transgenici sono ben sviluppati per lo studio delle funzioni dei geni negli embrioni di zebrafish, gli investigatori sono ancora affrontare l’arduo compito di generare gli alleli del mutante condizionali in zebrafish45,46. Così, transgenici mutanti dominanti negativi o piccole molecole sono frequentemente utilizzato …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. IC Bruce per osservazioni critiche e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 e 31521062), Asia di AstraZeneca e medicina innovativa mercato emergenti e lo sviluppo iniziale.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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