Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde
Summary
Koşullu gen-nakavt veya etkili gen-nakavt yetişkin zebra balığı organlarında geliştirmek için büyük bir meydan okuma olarak kalır. Burada performans gösteren nanopartikül aracılı siRNA gen-yetişkin zebra balığı kalbinde susturmak, böylece yetişkin organlarda zebra balığı ve diğer canlılar çalışmak için yeni bir işlev kaybı yöntemi sağlayan bir protokol raporu.
Abstract
Memeliler kalp akut miyokard infarktüsü sonrası yeniden oluşturmak için çok sınırlı bir kapasiteye sahip. Öte yandan, Yetişkin zebra balığı kalbini apex rezeksiyon veya yapım o kalp rejenerasyon çalışması için bir önemli model organizma cryoinjury, sonra yeniden oluşturur. Ancak, işlev kaybı yöntemleri yetişkin organları için eksikliği kalp rejenerasyon yatan mekanizmaları anlayışlar kısıtladı. RNA müdahale farklı dağıtım sistemleri üzerinden genlerini memeli hücrelerinde ve model organizmalar susturulması için güçlü bir araçtır. Biz daha önce siRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri başarıyla hücreleri girin ve olağanüstü gene özgü köşenize Yenileyici yetişkin zebra balığı kalbinde neden bildirdin. Burada, basit, hızlı ve etkin iletişim kuralı dendrimer-aracılı siRNA teslimi ve gen susturmak için yenileyici yetişkin zebra balığı kalbinde mevcut. Bu yöntem, zebra balığı yetişkin organların işlevlerinde gen belirlemek için alternatif bir yaklaşım sağlar ve diğer canlılar için de uzatılabilir.
Introduction
Miyokard infarktüsü büyük bir ekonomik yük1dünya çapında önde gelen bir büyük sağlık tehdidi haline gelmiştir. Yetişkin memeli kalp yeniden ve skar doku ve sonraki kalp yetmezliği oluşumu için önde gelen yaralanma sonra makroskopik ölçüde kayıp cardiomyocytes doldurmak başarısız olur. Memeliler, zebra balığı kalp yaralanması, yapım o kalp yenilenme moleküler mekanizmaları araştıran bir ideal model organizma farklı türde sonra sağlam miyokardiyal yayılması yoluyla öncelikle kalp yenilenme yeteneğine sahip olan 2,3,4,5,6,7,8. Endojen mekanizmaları deşifre alttaki zebra balığı kalp rejenerasyon araştırma insan kalbi rejenerasyon9geliştirmek yeni tedavi stratejileri için arama heyecan verici alanıdır.
Genetik manipülasyon yöntemleri zebra balığı içinde kullanılabilir. Bunlar kurbağalar, piliç ve yanı sıra memelilerde zebra balığı10,11,12,13de yaygın olarak kullanılan morpholinos (MO) oluşur. MO hedef gen ekspresyonu yetişkin zebra balığı yüzgeci, beyin ve retina14,15,16,17,18,19verimli nakavt vardır. Knock down endojen gen ekspresyonu sadece zebra balığı embriyo zamanda yetişkin hayvan organları20,21,22, için kullanılan başka bir yapay oligonükleotid kilitli nükleik asit (LNA) olduğunu 23 , 24. ancak, yetişkinlerin kalpler için etkili işlev kaybı yöntemleri eksikliği organ rejenerasyon moleküler mekanizmaları eğitim bir engel kalmıştı. Mevcut, küçük molekül inhibitörleri veya baskın negatif mutant transgenik ifade öncelikle işlevi belirli bir gen veya yetişkin zebra balığı kalp rejenerasyon25,26 işlevini çalışmaya yol engellemek için kullanılır ,27. Ancak, tüm genler veya sinyal yolları bu yöntemleri için geçerlidir.
Preklinik hayvan çalışmalarında modelleri için28,29,30 RNA’ların (çift) küçük müdahale memeli hücrelerinde ve embriyo model organizmalar, hem de yetişkin organ fonksiyon kaybı analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır , 31 , 32. Çift etkili bir şekilde kullanıldığını genler tümörler33,34,35 ve cardiomyocytes36,37,38,39 susturmak için ,40 farklı dağıtım sistemleri ile. Son zamanlarda, biz birkaç farklı nano tanecikleri41,42,43, kullanarak Yenileyici yetişkin kalbinde verimli siRNA kapsüllenmiş nanopartikül gen-susturmak için bir roman araç sağlayan gelişmiş Yetişkin zebra balığı organlarında genlerin fonksiyonel çalışmalar. Bizim önceki çalışmalar41,42,43numaraya bağlı olarak, burada siRNA gen f-PAMAM-PEG-R9 kullanarak Yenileyici yetişkin zebra balığı kalbinde susturmak için basit, pratik ama güçlü iletişim kuralı mevcut dendrimers. Aldh1a2 (aldehid dehidrojenaz 1 Aile, üye A2) gen zebra balığı apex rezeksiyonundan sonra upregulated oldu ve Aldh1a2 ablasyon bloke kardiyak rejenerasyon44. Burada biz almak aldh1a2 gen nanopartikül kapsüllenmiş siRNA enjeksiyonu ile aracılı gen devirme verimliliği test etmek için bir örnek olarak. Bu iletişim kuralı, Yetişkin zebra balığı kalbine zebra balığı kalp rezeksiyon, nano tanecikleri kimyasal sentez ve nano tanecikleri siRNA kapsüllü bir teslim yöntemi için bir yordam içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı organları yetişkin kalp5de dahil olmak üzere çeşitli Yenileyici tam olarak kullanabilir. Transgenik ve genetik yöntemleri zebra balığı embriyo gen fonksiyonları eğitimi için iyi gelişmiş olmakla birlikte, araştırmacılar hala koşullu mutant gen zebra balığı45,46yılında üretme zor bir görev ile karşı karşıyayız. Böylece, transgenik baskın negatif mutantlar veya küçük molekül inhibitörleri …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El yazması okuma ve yazar Dr. IC Bruce kritik Yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 ve 31521062), AstraZeneca Asya ve gelişmekte olan piyasa yenilikçi ilaç ve erken gelişme gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
Referencias
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
