Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио
Summary
Это остается серьезной проблемой разработки условной гена нокаут или эффективным-нокдаун гена в органах взрослых рыбок данио. Здесь мы приводим протокол для исполняющих наночастиц опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого данио рерио, обеспечивая тем самым новый метод функция потерь для изучения органов взрослых в данио рерио и других модельных организмов.
Abstract
Млекопитающие имеют весьма ограниченные возможности для восстановления сердца после инфаркта миокарда. С другой стороны взрослых рыбок данио восстанавливает свое сердце после резекции верхушки или cryoinjury, что делает его организма важной моделью для изучения регенерации сердца. Однако отсутствие потери функции методов для органов взрослых ограничила идеи в механизмы, лежащие в основе регенерации сердца. Система РНК-интерференции через различные системы доставки является мощным инструментом для сайленсинга генов в клетках млекопитающих и модельных организмов. Мы уже ранее сообщали, что малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц успешно ввести клетки и привести к замечательным нокдаун ген специфического в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио. Здесь мы представляем простой, быстрый и эффективный протокол для доставки дендример опосредованной siRNA и сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио. Этот метод обеспечивает альтернативный подход для определения функции гена в органов взрослых в данио рерио и может быть распространено на другие модели организмов также.
Introduction
Инфаркт миокарда стал серьезной угрозой, приводит к огромным бременем вокруг мира1. Сердце взрослого человека млекопитающих не регенерировать и пополнить потерянные кардиомиоцитов в макроскопических масштабах после травмы, приводит к образованию рубцовой ткани и последующие сердечной недостаточности. В отличие от млекопитающих данио рерио способен регенерации сердца, главным образом через надежные миокарда распространения после различных видов травмы сердца, что делает его организма идеальная модель для изучения молекулярных механизмов регенерации сердца 2,3,4,5,6,,78. Расшифровка местных механизмов базовой регенерации сердца данио рерио является захватывающей области исследований в поисках роман терапевтических стратегий для улучшения человеческого сердца регенерации9.
В zebrafish доступны методы генетической манипуляции. Они состоят из морфолиновая (MO), которые также широко используются в лягушек, цыпленок и млекопитающих, кроме данио рерио10,11,12,13. MO имеет эффективное нокдаун целевого выражения гена в плавник взрослых рыбок данио, мозга и сетчатки14,,1516,,1718,19. К морю нуклеиновых кислот (LNA) является другой искусственный олигонуклеотида, используемый для сбить эндогенного ген выражение не только в zebrafish эмбриона, но и в, органов взрослых животных20,,2122 23 , 24. Однако отсутствие эффективных методов потери функции для взрослых сердец по-прежнему является препятствием в изучение молекулярных механизмов регенерации органов. В настоящее время, мелкомолекулярных ингибиторы или трансгенных выражение Доминант отрицательных мутантов главным образом используются для блокировки функции определенного гена или путь для изучения его функции в взрослых рыбок данио сердце регенерации25,26 ,27. Однако не все гены или сигнальных путей применимы для этих методов.
Вмешательства малые РНК (малые интерферирующие РНК) широко используются для анализа потери функции в mammalian клеток и эмбрионов модельных организмов, а также органов взрослых доклинические исследования в животных моделей28,29,30 , 31 , 32. Малые интерферирующие РНК эффективно использовались для молчание генов в опухоли33,,3435 и кардиомиоцитов36,,3738,39 ,40 через различных систем доставки. Недавно мы разработали эффективных малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых, используя несколько различных наночастиц41,,4243, обеспечивая новый инструмент для функциональные исследования генов в органах взрослых рыбок данио. Основываясь на наших предыдущих исследований41,42,43, здесь мы представляем простой, практические, но мощный протокол для малых интерферирующих РНК сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио, с помощью f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 дендримеров. Aldh1a2 (альдегид дегидрогеназа 1, член семьи A2) ген был upregulated после резекции верхушки данио рерио и абляции Aldh1a2 заблокирован сердца регенерации44. Здесь мы берем гена aldh1a2 в качестве примера для проверки эффективности нокдаун гена при посредничестве наночастиц инкапсулированное siRNA инъекции. Этот протокол содержит процедуру для резекции сердце данио рерио, химического синтеза наночастиц и метод доставки на малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц в сердце взрослого данио рерио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио рерио полностью способен регенерировать различных органов, включая взрослых сердца5. Хотя трансгенных и генетические методы развитая для изучения функций генов в эмбрионов у рыбок данио, следователи по-прежнему сталкивается с сложной задачей генерации условных мут…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-р Брюс IC для критических замечаний и читать рукопись. Эта работа была поддержана субсидий из национального естественных наук фонд Китая (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 и 31521062), AstraZeneca Азии и возникающие рынок инновационной медицины и раннего развития.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
Referencias
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
