Nanopartícula mediada por siRNA silenciamiento génico en corazón de pez cebra adulto
Summary
Sigue siendo un reto para desarrollar condicional knockout de genes o eficaz gene-caída en órganos del pez cebra adulto. Aquí divulgamos un protocolo para realizar nanopartículas mediado siRNA silenciamiento del gen en el corazón del pez cebra adulto, proporcionando un nuevo método de pérdida de función para el estudio de órganos adultos en pez cebra y otros organismos modelo.
Abstract
Los mamíferos tienen una capacidad muy limitada para regenerar el corazón después del infarto del miocardio. Por otro lado, el pez cebra adulto regenera su corazón después de la resección del ápice o criocauterización, convirtiéndolo en un organismo modelo importante para el estudio de regeneración de corazón. Sin embargo, la falta de métodos de pérdida de función de órganos adultos ha restringido penetraciones en los mecanismos subyacentes de la regeneración del corazón. ARN de interferencia a través de diferentes sistemas es una herramienta poderosa para silenciamiento de genes en células de mamífero y organismos modelo. Hemos divulgado previamente que nanopartículas encapsuladas de siRNA con éxito entrar en las células y resultan en una caída notable de gene-específicas en el corazón de pez cebra adulto regeneración. Aquí, presentamos un protocolo sencillo, rápido y eficiente para la entrega del dendrímero mediada por siRNA y silenciamiento del gen en el corazón regeneración del pez cebra adulto. Este método ofrece un enfoque alternativo para la determinación de funciones de genes en órganos adultos en el pez cebra y puede ampliarse a otros organismos modelo así.
Introduction
Infarto de miocardio se ha convertido en una amenaza de salud, llevando a una enorme carga económica alrededor del mundo1. El corazón mamífero adulto no puede regenerarse y reponer los cardiomiocitos perdidos en una escala macroscópica después de la lesión, conduciendo a la formación de los tejidos de la cicatriz y la insuficiencia cardíaca posterior. A diferencia de los mamíferos, el pez cebra es capaz de regeneración del corazón, principalmente a través de la proliferación miocardio robusta después de diferentes tipos de lesiones del corazón, lo que es un organismo modelo ideal para investigar los mecanismos moleculares de la regeneración del corazón 2,3,4,5,6,7,8. Descifrando los mecanismos endógenos subyacentes regeneración del corazón del pez cebra es un área apasionante de investigación en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas mejorar la regeneración de corazón humano9.
Existen métodos de manipulación genética en el pez cebra. Éstos consisten en morfolinos (MO) que son también ampliamente utilizados en las ranas, pollo y mamíferos además de en el pez cebra10,11,12,13. MO tiene precipitación eficiente de la expresión génica de blanco en la aleta del pez cebra adulto, el cerebro y la retina14,15,16,17,18,19. El ácido nucleico bloqueado (LNA) es otro oligonucleótido artificial utilizado para derribar a la expresión del gen endógeno no sólo en embriones de pez cebra, pero también en órganos animales adultos20,21,22, 23 , 24. sin embargo, la falta de métodos eficaces de pérdida de función de corazones adultos sigue siendo un obstáculo en el estudio de los mecanismos moleculares de la regeneración de órganos. En el presente, moléculas pequeñas inhibidores o expresión transgénica de mutantes dominantes negativos se utilizan principalmente para bloquear la función de un determinado gen o vía para el estudio de su función en el pez cebra adulto corazón regeneración25,26 ,27. Sin embargo, no todos los genes o vías de señalización son aplicables para estos métodos.
RNAs interferentes pequeños (siRNAs) son ampliamente utilizados para el análisis de pérdida de función en células de mamífero y los embriones de organismos modelo, como órganos de adultos para los estudios preclínicos en animales modelos28,29,30 , 31 , 32. siRNAs se han utilizado con eficacia para silenciar genes en tumores33,34,35 y en cardiomiocitos36,37,38,39 ,40 través de diferentes sistemas. Recientemente, hemos desarrollado eficientes nanopartículas encapsuladas de siRNA silenciamiento del gen en el corazón adulto regeneración utilizando varios diferentes nanopartículas41,42,43, proporcionando una herramienta novedosa para estudios funcionales de genes en órganos del pez cebra adulto. Basado en nuestros anteriores estudios41,42,43, aquí presentamos un protocolo, práctico, sencillo y potente de siRNA silenciamiento del gen en el corazón de pez cebra adulto regeneración utilizando f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros. Aldh1a2 (aldehído deshidrogenasa 1, miembro de la familia A2) gene era upregulated después de la resección del ápice de pez cebra y ablación de Aldh1a2 bloquea la regeneración cardiaca44. Aquí tomamos el gen aldh1a2 como ejemplo para probar la eficiencia de precipitación de genes mediada por siRNA nanopartículas encapsuladas inyección. Este protocolo contiene un procedimiento de resección de corazón de pez cebra, síntesis química de las nanopartículas y un método de entrega en nanopartículas encapsuladas de siRNA en corazón de pez cebra adulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra es completamente capaz de regenerar una variedad de órganos incluyendo el corazón adulto5. Métodos genéticos y transgénicos son desarrollados para el estudio de las funciones del gene en los embriones de pez cebra, los investigadores todavía se enfrentan a la ardua tarea de generar alelos mutantes condicionales en el pez cebra45,46. Por lo tanto, transgénicos mutantes dominantes negativos o inhibidores de moléculas peq…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Dr. IC Bruce de comentarios críticos y leyendo el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 y 31521062), AstraZeneca Asia y emergentes mercado medicina innovadora y desarrollo temprano.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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