Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie
Summary
Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.
Abstract
Door zich te concentreren in lage-intensiteit ultrageluid pulsen die doordringen van de zachte weefsels, vertegenwoordigt LIPUS een veelbelovende biomedische technologie voor het op afstand en veilig manipuleren neurale afvuren, hormonale secretie en genetisch geherprogrammeerd cellen. Echter wordt de vertaling van deze technologie voor medische toepassingen momenteel gehinderd door een gebrek aan biofysische mechanismen waarmee gericht weefsels gevoel en te reageren op LIPUS. Een geschikte benadering voor het identificeren van deze mechanismen zou moeten gebruiken van optische biosensoren in combinatie met LIPUS om te bepalen onderliggende signaalroutes. Echter, de LIPUS tot en met een fluorescentie Microscoop kan leiden tot ongewenste mechanische artefacten als gevolg van de aanwezigheid van fysieke interfaces die weerspiegelen, absorberen en akoestische golven breken. Dit artikel bevat een stapsgewijze procedure om op te nemen LIPUS aan verkrijgbare rechtop epi-fluorescentie microscopen terwijl het minimaliseren van de invloed van fysieke interfaces de akoestische weg. Een eenvoudige procedure is beschreven te bedienen een transducer één element echografie en voldoen aan de focale zone van de transducer brengen het objectieve focal point. Het gebruik van LIPUS is geïllustreerd met een voorbeeld van LIPUS-geïnduceerde calcium transiënten in gekweekte menselijke glioblastoma cellen gemeten met behulp van calcium imaging.
Introduction
Veel ziekten vereist enige vorm van invasieve medische interventie. Deze procedures zijn vaak duur en riskant en vereisen herstel periodes dus het toevoegen van een last aan stelsels voor gezondheidszorg. Niet-invasieve therapeutische modaliteiten hebben het potentieel om veiligere en goedkopere alternatieven voor conventionele chirurgische ingrepen. Huidige niet-invasieve benaderingen zoals farmacotherapie of Transcraniële magnetische stimulatie zijn echter vaak beperkt door afwegingen tussen weefsel penetratie, Spatio resolutie en ongewenste effecten van de af-target. In dit verband vormt een gerichte echografie een veelbelovende niet-invasieve technologie met het potentieel om te manipuleren van de biologische functies diep in de weefsels met hoge Spatio nauwkeurigheid en beperkte af-target effecten.
Gerichte echografie stimulatie bestaat uit het leveren van akoestische energie op exacte locaties diep in levende organismen. Afhankelijk van de akoestische pulse parameters, kan deze energie hebben een verscheidenheid van medische toepassingen. Bijvoorbeeld, heeft de Food and Drug Administration het gebruik van High-intensity geconcentreerd ultrageluid (HiFU) goedgekeurd voor thermische ablatie van tumoren van de prostaat, tremor-veroorzakende hersengebieden, uteriene vleesbomen en zenuwuiteinden pijn veroorzaakt in de botmetastasen1 . HiFu-gemedieerde microbubble cavitatie wordt ook gebruikt voor Transient openen de bloed – hersen barrière voor de beoogde levering van systemisch bestuurde therapeutics2. De ruimtelijke-piek pulse-gemiddelde intensiteit (Isppa) en de ruimtelijke-piek temporele-gemiddelde intensiteit (iknieuwsagentschap) gebruikt voor HiFU toepassingen zijn meestal boven verschillende kW cm-2 en produceren pulse druk van enkele tientallen MPa. Deze intensiteitswaarden zijn ver boven de FDA-goedgekeurde iksppa en iknieuwsagentschap limieten voor diagnostische echografie, 190 W cm-2 en 720 mW cm-2, respectievelijk3. In tegenstelling, hebben recente studies aangetoond dat niet-destructieve gepulseerde echografie stimulatie die binnen of in de buurt van het bereik van de plafonds voor de intensiteit diagnostische echografie (LIPUS) kan worden effectief te ver en veilig manipuleren neurale afvuren4, 5,6,7,8, hormonale secretie9,10 en bioengineered cellen11. Toch zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee cellen voelen en reageren op echografie nog steeds onduidelijk, uitschakeling van klinische vertaling van LIPUS. Vandaar, in de afgelopen jaren onderzoek naar kunstmatige membranen, gekweekte cellen en dieren gestimuleerd met echografie hebben een stroomversnelling te onthullen biofysische en fysiologische processen gemoduleerd door LIPUS12,13, 14,,15.
Geluid bestaat uit een trilling teeltmateriaal via een fysiek medium. Een echografie is een geluid met een frequentie hoger dan de mens hoorbare bereik (i.e., boven 20 kHz). In de omgeving van een laboratorium, zijn ultrasone golven over het algemeen geproduceerd door piëzo-elektrische omvormers die bevatten een materiaal dat naar aanleiding van een elektrisch veld oscillerende in een specifieke bandbreedte van hoge-frequentie trilt. Er bestaan twee soorten omvormers: één element transducers en transducer matrices. Piëzo-elektrische omvormers van één element bezitten een gebogen oppervlak dat fungeert als een focus lens en vandaar concentreert akoestische energie in een bepaald gebied genaamd de focale zone. Enkel element omvormers zijn veel goedkoper en gemakkelijker te bedienen dan transducer matrices. Dit artikel zal zich richten op één element omvormers.
De grootte van de focale zone van een gerichte enkel element transducer hangt af van de geometrische eigenschappen van de akoestische lens en de akoestische frequentie. Om te bereiken een focale millimeter-grootte-zone met een enkel element transducer, zijn ultrasone frequenties in het bereik MHz in het algemeen vereist. Akoestische golven op deze frequentie zijn helaas zeer snel verzwakt wanneer doorgegeven in een ijle medium zoals lucht. Aldus, moeten MHz ultrasone golven worden gegenereerd en doorgegeven aan het monster in een dichtere materiaal zoals water. Dit is de eerste uitdaging bij de integratie van de LIPUS modaliteit aan een microscoop.
Een tweede uitdaging is om te minimaliseren van de fysieke interfaces tussen materialen met verschillende akoestische impedances (dat is een product van materiële dichtheid en de akoestische snelheid) langs het akoestische pad. Deze interfaces kunnen reflecteren, breken, scatter en absorberen van akoestische golven, waardoor het moeilijk te kwantificeren van het bedrag van akoestische energie effectief geleverd aan een monster. Ze kunnen ook ongewenste mechanische artefacten maken. Bijvoorbeeld, maken reflecties geproduceerde loodrecht op akoestische mismatch impedantie interfaces backpropagating golven die met vooruit-teeltmateriaal ones interfereren. De storing weg annuleren de golven elkaar op vaste regio’s van ruimten genaamd knooppunten en samengevat op afwisselende regio’s anti-knooppunten, creëren van zogenaamde staande golven (Figuur 1). Het is belangrijk voor de Vejle te kunnen beheren of elimineren van deze experimentele interfaces in vitro als ze niet in vivo bestaat.
Meting van de fluorescentie van optische verslaggevers is een bekende methode om te ondervragen transparante biologische monsters in real-time en met geen fysieke storingen. Deze aanpak is dus ideaal voor LIPUS studies zoals elke fysieke sondes aanwezig in het sonicated gebied mechanische artefacten introduceren zal. Dit protocol beschrijft de uitvoering en de werking van LIPUS naar een commerciële epi-fluorescentie Microscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een grote voordeel van geconcentreerd ultrageluid is haar vermogen om te leveren niet-gebeurt mechanisch en/of thermische energie aan biologische monsters met een hoge spatio-temporele precisie. Andere technieken die mechanisch stimuleren cellen meestal dienst invasieve fysische sondes (bijvoorbeeld cel-prikken) of de interactie van energierijke laserstralen met vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld optisch pincet) vereist. Magnetische verwarming kan verhitten specifieke ruimtelijke locaties binnen biologisc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Mikhail Shapiro en Nikita Reznik voor vruchtbare discussies. Dit werk werd gesteund door start-up fondsen van Western University of Health Sciences en NIH grant R21NS101384.
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
Referencias
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. . Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O’Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
