多重蛍光顕微鏡と超音波刺激を集中
Summary
低出力パルス超音波刺激 (体表) は内因的あるいは人工的高時空間分解能細胞の非侵襲的な機械的刺激の様相です。この記事では、エピ蛍光顕微鏡に体表を実装する方法と、不要な機械工芸品を防ぐために超音波のパスに沿って音響インピー ダンスのミスマッチを最小限に抑える方法について説明します。
Abstract
軟部組織に浸透する低強度超音波パルスを中心に、体表はリモートでかつ安全に発火、ホルモン分泌、細胞の遺伝的再プログラムを操作するための有望な医療技術を表します。ただし、この医療技術の翻訳はによって妨げられている現在、生物物理学的メカニズムの欠如組織感覚を対象とし、体表に対応します。これらのメカニズムを識別するために適切なアプローチは、体表との組み合わせで光バイオ センサーを使用し、シグナル伝達経路の基になることでしょう。ただし、蛍光顕微鏡に体表を実装する物理インタ フェースを反映し、吸収し、弾性波の屈折が存在するため望ましくない機械工芸品を導入可能性があります。この記事は、音響経路の物理インタ フェースの影響を最小限に抑えながら市販の直立したエピ蛍光顕微鏡に体表を組み込むためのステップバイ ステップの手順を示します。単一素子超音波トランスデューサーを動作し、客観的のフォーカル ポイントにトランスデューサーの焦点ゾーンをもたらす簡単な手順を説明します。体表の使用は、ヒトグリオブラストーマ細胞のカルシウム イメージングを用いて体表誘起カルシウム過渡現象の例で示されています。
Introduction
多くの病気は、侵襲的な医療の介入のいくつかのフォームを必要とします。これらの手順は、高価で危険な回復期間を必要とする、従って健康管理システムに負担を追加します。非侵襲的治療戦略には、従来の外科手術を安全かつ安価な選択肢を提供する可能性があります。ただし、薬物療法や経頭蓋磁気刺激など現在の非侵襲的なアプローチはしばしば組織浸透、時空間分解能および不要なオフターゲット効果のトレードオフによって限られます。このコンテキストで集束超音波が生体機能を操作する可能性のある有望な非侵襲的技術を構成する時空間精度とターゲットを離れて影響が限定的組織の奥深く。
集束超音波刺激から成っている正確な位置に音響エネルギーを提供する生きている有機体の奥深く。音響パルス パラメーターによってこのエネルギーは、さまざまな医療用途を持つことができます。食品医薬品局が骨転移1 の神経終末の痛みの原因となる子宮筋腫、脳領域の振戦の原因となる前立腺腫瘍熱焼灼法に用いる高強度集束超音波 (HiFU) の使用を承認は、例えば、.HiFu を介したマイクロバブル キャビテーションはまた一時的治療薬の全身投与2のターゲットを絞った配信のため血液脳関門を開くに使用されます。局所ピーク パルス平均強度 (私sppa) と空間ピーク時間平均強度 (私のこぎり spta) HiFU いくつか kW cm-2上は、通常、MPa の数十の脈圧を生成するアプリケーションに使用されます。これらの強度値sppaと私 FDA 承認をはるかに上回っている私、超音波診断、190 W cm-2 720 mW cm-23それぞれスプタ制限。対照的に、最近の研究は、内または診断超音波強度制限 (体表) の範囲に近いことができますリモートでかつ安全に操作神経に効果的な発射4は、その非破壊パルス超音波刺激を示されています。 5,6,7,8, ホルモン分泌9,10 , 遺伝子組み換え細胞11。まだ、細胞が感知し、超音波応答細胞および分子メカニズムは不明、体表の臨床的翻訳を排除します。したがって、過去数年の人工膜、培養細胞と動物の超音波で刺激された研究生物物理を明らかにするはずみがつきましたが、生理的変調体表12,13、 14,15。
音は、物理的な媒体を介して伝播する振動で構成されています。超音波は、人間の可聴範囲 (すなわち、 20 kHz 以上) 以上の周波数を持つ音です。実験室の設定で、超音波は一般的に特定の高周波帯域で振動する電場に応答振動する物質を含む圧電トランスデューサー プロデュースします。探触子の 2 種類があります: 単一のエレメント ・ トランスデューサーと探。一振圧電トランスデューサーでは、焦点レンズとして機能し、それ故に音響エネルギーを集中して焦点のゾーンと呼ばれる定義済みの領域に曲面を所有しています。一振がはるかに安く、トランスデューサー配列よりも扱いやすいです。この記事は一振に焦点を当てます。
焦点を当てた一振の焦点ゾーンのサイズには、音響レンズの幾何学的性質とその音響周波数が決まります。一振をミリメートル サイズの焦点ゾーンを達成するため、MHz の範囲の超音波頻度が一般的に必要です。残念ながら、空気などの希薄な培地で伝達されるとき、そのような周波数の音波非常に急速に減衰されます。したがって、MHz の超音波は生成して水などより密な材料のサンプルに反映する必要があります。これは、顕微鏡に体表のモダリティを統合の最初の挑戦を構成します。
2 番目の課題は、異なる音響インピー ダンス (材料の密度および音響の速度の製品である) 音響のパスに沿って材料間の物理インタ フェースを最小化することです。これらのインタ フェースを反映することができます、屈折、散乱・ サンプルを効果的に配信される音響エネルギーの量を定量化するが難しく、音波を吸収します。彼らは、不要な機械工芸品を作成することも。例えば、反射作り出された音響に垂直な不一致インピー ダンス インターフェイスは、前方を伝播するものを妨げる逆伝搬波を作成します。干渉パスに沿って波互いを取り消すと呼ばれるノードと交互になる反ノードと呼ばれる地域を合計スペースの固定地域でいわゆる定在波 (図 1) を作成します。験者を制御または彼らがで生体内に存在しないこれらの実験的インターフェイス体外を排除できるように重要です。
光記者の蛍光測定は、ない物理的な妨害とリアルタイムで透明な試料を尋問するよく知られている方法です。この方法、任意の物理的なプローブの熱量の領域内に存在、機械工芸品を紹介する体表の研究に最適です。このプロトコルは、実装および商業エピ蛍光顕微鏡に体表の操作について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
集束超音波の主な利点は、非侵襲的時空間的精度の高い試料に機械的および/または熱エネルギーを提供する能力です。他の手法が機械的に刺激するために使用されて通常 (例えば、携帯つつく) 採用侵襲的な物理的なプローブを細胞や異物 (例えば、光学ピンセット) と高エネルギー レーザーの相互作用が必要です。磁気加熱生体試料中の特定の空間位置を熱することができる外…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
有意義な議論、夫妻ミハイル ・ シャピロとニキータ Reznik に感謝します。この作品は、西部保健大学からスタートアップ資金によって支えられたし、NIH は R21NS101384 を付与します。
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
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