Multiplexing focalizzato ad ultrasuoni stimolazione con microscopia di fluorescenza

Summary

Bassa intensità ha pulsato ultrasuono stimolazione (LIPUS) è una modalità per stimolazione meccanica non invasiva delle cellule endogene o ingegnerizzate con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questo articolo viene descritto come implementare LIPUS ad un microscopio a epifluorescenza e come ridurre al minimo disadattamento di impedenza acustica lungo il percorso di ultrasuono per evitare indesiderati artefatti meccanici.

Abstract

Mettendo a fuoco gli impulsi di ultrasuoni a bassa intensità che penetrano i tessuti molli, LIPUS rappresenta una promettente tecnologia biomedica in remoto e in modo sicuro manipolare infornamento neurale, secrezione ormonale e cellule geneticamente riprogrammate. Tuttavia, la traduzione di questa tecnologia per applicazioni mediche attualmente è ostacolata da una mancanza di meccanismi biofisici che mirate senso tessuti e rispondere a LIPUS. Un approccio adatto per identificare questi meccanismi sarebbe utilizzare biosensori ottici in combinazione con LIPUS per determinare sottostanti vie di segnalazione. Tuttavia, l’implementazione LIPUS al microscopio a fluorescenza possono introdurre artefatti indesiderati meccaniche dovuta alla presenza di interfacce fisiche che riflettono, assorbono e rifrangere le onde acustiche. Questo articolo presenta una procedura dettagliata per incorporare LIPUS reperibile in posizione verticale epi-fluorescenza microscopi, riducendo al minimo l’influenza delle interfacce fisiche lungo il percorso acustico. Una procedura semplice è descritta per operare un trasduttore ad ultrasuoni elemento singolo e per portare la zona focale del trasduttore nel punto focale obiettivo. L’utilizzo di LIPUS è illustrato con un esempio dei transienti di calcio LIPUS-indotta in cellule di glioblastoma umano colto misurate usando la formazione immagine del calcio.

Introduction

Molte malattie richiedono una qualche forma di intervento medico invasivo. Queste procedure sono spesso costosi, rischioso, richiedono periodi di recupero e quindi aggiungere un peso ai sistemi sanitari. Modalità terapeutiche non invasivi hanno il potenziale per fornire alternative più sicure ed economiche per procedure chirurgiche convenzionali. Tuttavia, approcci attuali non invasiva come farmacoterapia o transcranial stimolazione magnetica sono spesso limitati di trade-off tra penetrazione tissutale, risoluzione spazio-temporale ed effetti indesiderati fuori bersaglio. In questo contesto, un ultrasuono messo a fuoco costituisce una promettente tecnologia non invasiva con il potenziale per manipolare le funzioni biologiche profonde all’interno dei tessuti con alta esattezza spatiotemporal ed effetti limitati fuori bersaglio.

Ultrasuono messo a fuoco la stimolazione consiste di erogare energia acustica in posizioni precise profondo all’interno di organismi viventi. A seconda dei parametri di impulso acustico, questa energia può avere una varietà di usi medici. Per esempio, la Food and Drug Administration ha approvato l’uso di ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HiFU) per termoablazione di tumori della prostata, regioni del cervello che causano tremore, fibromi uterini e terminazioni nervose causando dolore metastasi ossee¹ . HiFu-mediata microbolle cavitazione è utilizzato anche per aprire transitoriamente la barriera emato – encefalica per la somministrazione mirata di somministrazione sistemica terapeutica². L’intensità di impulso-media spaziale-picco (mi_sppa) e spaziali-picco temporale-media intensità (mi_spta) utilizzato per HiFU applicazioni sono in genere sopra parecchi kW cm^-2 e producono pressione di impulso di diverse decine di MPa. Questi valori di intensità sono molto di sopra della FDA ha approvato_sppa e mi_spta limiti per diagnostico ad ultrasuoni, 190 W cm^-2 e 720 mW cm^-2, rispettivamente³. Al contrario, recenti studi hanno dimostrato che la stimolazione non distruttivi ad ultrasuoni pulsata che sono all’interno o nei pressi dei limiti di intensità di diagnostica ad ultrasuoni (LIPUS) può essere efficace in remoto e in modo sicuro manipolare neurale di cottura^{4, 5,6,7,8}, secrezione ormonale^9,10 e Bioingegneria cellule¹¹. Ancora, i meccanismi cellulari e molecolari mediante il quale le cellule percepiscono e rispondere ai ultrasuono rimangono poco chiari, precludendo traslazione clinica LIPUS. Quindi, negli ultimi anni, studi di membrane artificiali, cellule coltivate e animali stimolati con ultrasuoni hanno acquisito slancio per rivelare biofisiche e processi fisiologici modulata da LIPUS^{12,13, 14,15}.

Suono è costituito da una vibrazione di moltiplicazione attraverso un supporto fisico. L’ecografia è un suono con una frequenza di sopra della gamma udibile umana (cioè, sopra i 20 kHz). In un ambiente di laboratorio, gli ultrasuoni sono generalmente prodotti da trasduttori piezoelettrici che contengono un materiale che vibra in risposta a un campo elettrico oscillante in una specifica larghezza di banda ad alta frequenza. Esistono due tipi di trasduttori: singolo elemento trasduttori e matrici di trasduttore. Trasduttori a singolo elemento piezoelettrico possiedono una superficie curva che agisce come una lente di focalizzazione e quindi si concentra energia acustica in una regione definita chiamata la zona focale. Trasduttori a singolo elemento sono molto più economico e più facile da gestire rispetto alle matrici di trasduttore. Questo articolo si concentrerà sui trasduttori a singolo elemento.

La dimensione della zona focale di un trasduttore a singolo elemento dipende dalla proprietà geometriche della lente acustica e la sua frequenza acustica. Per raggiungere una zona focale di millimetro-dimensione con un trasduttore a singolo elemento, ultrasuoni frequenze nella gamma MHz sono generalmente richieste. Purtroppo, onde acustiche a tale frequenza vengono attenuate molto rapidamente quando si propaga in un mezzo tenue come l’aria. Pertanto, onde ad ultrasuoni MHz necessario essere generato e propagato al campione in un materiale più denso come l’acqua. Ciò costituisce la prima sfida di integrare modalità LIPUS ad un microscopio.

Una seconda sfida è di minimizzare le interfacce fisiche tra materiali con diverse impedenze acustiche (che è un prodotto della densità del materiale e la velocità acustica) lungo il sentiero acustico. Queste interfacce possono riflettere, rifrangere, dispersione e assorbire le onde acustiche, che lo rende difficile quantificare la quantità di energia acustica efficacemente consegnato ad un campione. Possono inoltre creare manufatti meccanici indesiderati. Per esempio, riflessioni mancata corrispondenza perpendicolare all’acustica prodotta impedenza interfacce creano onde backpropagating che interferiscono con quelli di propagazione in avanti. Lungo il percorso di interferenza, le onde annullano a vicenda alle regioni fisse degli spazi chiamati nodi e riassumere a alternata regioni chiamate anti-nodi, creando le cosiddette onde stazionarie (Figura 1). È importante per lo sperimentalista essere in grado di controllare o eliminare queste interfacce sperimentali in vitro , come non possono esistere in vivo.

Misura di fluorescenza del reporter ottico è un noto metodo per interrogare i campioni biologici trasparenti in tempo reale e con nessun disturbo fisico. Questo approccio è quindi ideale per gli studi LIPUS come eventuali sonde fisici presente nella zona lisati mediante introdurrà manufatti meccanici. Questo protocollo descrive l’attuazione e il funzionamento del LIPUS ad un microscopio a epifluorescenza commerciale.

Protocol

1. crescita delle cellule su acusticamente trasparente pellicola di poliestere Praticare una dimensione del foro di 12 mm nella parte inferiore di una piastra di coltura standard da 35 mm con un trapano verticale a stampa. Spostare lentamente il trapano e indossare occhiali di protezione. Rimuovere i pezzi di plastica attaccato al fondo del piatto con una lama per creare una superficie liscia sul lato esterno (Figura 2). Applicare un sottile strato di resina epossidica ma…

Representative Results

Figura 5 è un esempio di esperimento LIPUS multiplexata con formazione immagine del calcio. Le cellule di glioblastoma (A-172) sono state coltivate su pellicola di poliestere EMPM rivestito in terreno di coltura standard (supplementato con 10% siero e 1% antibiotici) e incubate con il reporter fluorescente sensibili del calcio Fluo-4 AM. Le cellule erano imaged utilizzando un obiettivo 10x immersione e illuminata con una sorgente di luce bianca LED e luce di…

Discussion

Un vantaggio principale di ultrasuoni focalizzati è la sua capacità di non invadente erogare energia meccanica e/o termica a campioni biologici con alta precisione spazio-temporale. Altre tecniche destinate a stimolare meccanicamente cellule solitamente impiegano sonde fisico invasivo (ad es., cella-frugando) o richiede l’interazione di raggi laser ad alta energia con corpi estranei (ad es., pinzette ottiche). Riscaldamento magnetico può riscaldare specifiche posizioni spaziali all’interno di campion…

Materials

upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107