Multiplexen fokussiert Ultraschall-Stimulation mit Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Niedrige Intensität pulsierte Ultraschall Stimulation (LIPUŠ) ist eine Modalität für nicht-invasive mechanische Stimulation der endogenen oder veränderter Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Dieser Artikel beschreibt wie LIPUŠ zu einem Epi-Fluoreszenz-Mikroskop zu implementieren und akustische Impedanzfehlanpassung auf dem Ultraschall Weg zu verhindern, dass unerwünschte mechanische Artefakte zu minimieren.
Abstract
Durch die Konzentration geringer Intensität Ultraschall-Impulse, die weiche Gewebe eindringen, stellt LIPUŠ eine viel versprechende Biomedizinische Technologie, aus der Ferne und sicher neuronale feuern, hormonellen Sekretion und genetisch umprogrammiert Zellen zu manipulieren. Allerdings ist die Übersetzung dieser Technologie für medizinische Anwendungen derzeit durch behindert, mangelnder biophysikalischen Mechanismen mit denen gezielt Gewebe Sinn und reagieren auf LIPUŠ. Ein geeigneter Ansatz, diese Mechanismen zu identifizieren wäre, optische Biosensoren in Kombination mit LIPUŠ verwenden, um die zugrunde liegenden Signalwege zu bestimmen. Umsetzung LIPUŠ zu einem Fluoreszenzmikroskop kann jedoch unerwünschte mechanische Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von physikalischen Schnittstellen einführen, die reflektieren, absorbieren und akustische Wellen brechen. Dieser Artikel stellt eine Schrittanleitung um LIPUŠ zu handelsüblichen aufrecht Epi-Fluoreszenz Mikroskope zu integrieren, bei gleichzeitiger Minimierung des Einfluss der physikalischen Schnittstellen den akustischen Weg. Ein einfaches Verfahren bezeichnet man einen Single-Element-Ultraschall-Wandler zu betreiben und der Fokuszone des Wandlers in den objektiven Brennpunkt bringen. Die Verwendung von LIPUŠ wird anhand eines Beispiels der LIPUŠ-induzierte Kalzium Transienten in kultivierten menschlichen Glioblastom-Zellen mit Kalzium Bildgebung gemessen dargestellt.
Introduction
Viele Krankheiten erfordern eine Form der invasiven medizinischen Eingriff. Diese Verfahren sind oft teuer, riskant, Erholungsphasen erfordern und so eine Belastung zu Gesundheitssystemen hinzufügen. Nicht-invasive therapeutische Modalitäten haben das Potenzial, sicherere und billigere Alternativen zu herkömmlichen chirurgischen Eingriffen bieten. Aktuelle nicht-invasive Ansätze wie Pharmakotherapie oder transkranielle Magnetstimulation sind jedoch oft durch Trade-Offs zwischen Gewebe eindringen, räumlich-zeitliche Auflösung und Ziel Nebenwirkungen begrenzt. In diesem Zusammenhang eine Ultraschall stellt eine viel versprechende nicht-invasive Technologie das Potenzial zur biologische Funktionen manipulieren tief in Gewebe mit hoher räumlich-zeitliche Genauigkeit und begrenzte off-Target-Wirkung.
Ultraschall-Stimulation besteht aus Schallenergie an genauen Standorte liefern tief in lebenden Organismen. Je nach akustischen Pulsparameter kann diese Energie eine Vielzahl von medizinischen Anwendungen haben. Zum Beispiel, der Food and Drug Administration genehmigt die Verwendung von hochintensivem fokussierten Ultraschall (HiFU) für thermische Ablation von Prostatatumoren, Tremor verursachen Hirnregionen, Myome und Schmerz verursachende Nervenenden in Knochenmetastasen1 . HiFu-vermittelten Mikroblasen Kavitation dient auch vorübergehend die Blut – Hirn-Schranke für die gezielte Bereitstellung von systemisch verabreicht Therapeutika2öffnen. Die räumliche Peak-Puls-Durchschnitt-Intensität (ichSppa) und räumliche Peak zeitlichen Durchschnitt-Intensität (ichBÜPF) verwendet für HiFU-Anwendungen sind in der Regel über mehrere kW cm-2 und Pulsdruck von mehreren zehntausend MPa zu produzieren. Diese Intensitätswerte sind weit über die FDA-Zulassung ichSppa und ichSpta Grenzwerte für diagnostischen Ultraschall, 190 W cm-2 und 720 mW cm-2, bzw.3. Im Gegensatz dazu, haben neuere Studien gezeigt, dass zerstörungsfreie gepulster Ultraschall-Stimulation, die innerhalb oder in der Nähe das Spektrum der diagnostischen Ultraschall Intensität Grenzen (LIPUŠ) effektiv, sicher und aus der Ferne neuronale manipulieren4ausgelöst werden kann, 5,6,7,8, hormonellen Sekretion9,10 und biotechnologisch Zellen11. Und doch bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die Zellen spüren und reagieren auf Ultraschall, unklar, klinische Übersetzung der LIPUŠ entgegensteht. Daher in den letzten Jahren Studien von künstlichen Membranen, kultivierten Zellen und Tieren mit Ultraschall angeregt haben zugenommen, biophysikalische offenbaren und physiologische Prozesse moduliert durch LIPUŠ12,13, 14,15.
Ton besteht aus einer Schwingung durch ein physikalisches Medium. Eine Ultraschalluntersuchung ist ein Ton mit einer Frequenz oberhalb der menschlichen Hörbereich (d. h. über 20 kHz). In einer Laborumgebung entstehen Ultraschallwellen in der Regel durch piezoelektrische Sensoren, die ein Material enthalten, das als Reaktion auf ein elektrisches Feld in eine bestimmte Bandbreite von Hochfrequenz-oszillierende schwingt. Es gibt zwei Arten von Sensoren: single Element Sensoren und Wandler-Arrays. Einzelelement piezoelektrische Sensoren besitzen eine gekrümmte Oberfläche wirkt wie eine Linse und damit akustische Energie in einer definierten Region namens der Fokuszone konzentriert. Einzelnes Element Wandler sind viel billiger und einfacher zu bedienen als Wandler-Arrays. Dieser Artikel konzentriert sich auf einzelnes Element Wandler.
Die Größe der Fokuszone einen fokussierten Einzelelement-Wandler richtet sich auf die geometrischen Eigenschaften der akustischen Linse und auf seine akustische Frequenz. Um einen Millimeter Größe Fokuszone mit ein einzelnes Element Wandler zu erreichen, sind Ultraschall-Frequenzen im MHz-Bereich in der Regel erforderlich. Akustische Wellen bei dieser Frequenz werden leider sehr schnell abgeschwächt, in einem dünn Mittel wie Luft weitergegeben. Daher müssen MHz Ultraschall-Wellen generiert und an die Probe in ein dichteres Material wie Wasser weitergegeben werden. Dies ist die erste Herausforderung bei der Integration von LIPUŠ Modalität an ein Mikroskop.
Eine zweite Herausforderung ist es, physikalische Schnittstellen zwischen Materialien mit unterschiedlichen akustischen Impedanzen (das ist ein Produkt der Materialdichte und der Schallgeschwindigkeit) den akustischen Weg zu minimieren. Diese Schnittstellen können reflektieren, brechen Sie, zerstreuen und absorbieren Sie akustische Wellen, so dass es schwer zu quantifizieren, die Höhe der akustischen Energie effektiv zu einer Probe geliefert. Sie können ebenfalls unerwünschte mechanische Artefakte erstellen. Zum Beispiel erzeugen Reflexionen produzierten senkrecht zur akustischen Fehlanpassung Impedanz Schnittstellen Backpropagating Wellen, die vorwärts-Vermehrung zu stören. Des Weges der Störungen abbrechen die Wellen gegenseitig bei festen Regionen von Räumen, die als Knoten und fassen an wechselnden Regionen Anti-Knoten genannt, erstellen sogenannte stehende Wellen (Abbildung 1). Es ist wichtig für den Experimentator in der Lage zu kontrollieren oder diese experimentellen Interfaces in Vitro zu beseitigen, da sie möglicherweise nicht in Vivovorhanden sein.
Fluoreszenzmessung der optischen Reporter ist eine bekannte Methode, transparente biologischen Proben in Echtzeit und mit keinen körperlichen Störung zu befragen. Dieser Ansatz ist somit ideal für LIPUŠ Studien wie jede physikalische Sonden in das beschallte Gebiet mechanische Artefakte einführen werden. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung und den Betrieb von LIPUŠ zu einem kommerziellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Hauptvorteil des fokussierten Ultraschalls ist seine Fähigkeit, nicht-invasiv mechanischer und/oder thermischer Energie an biologischen Proben mit hoher räumlich-zeitliche Präzision zu liefern. Andere Techniken zur mechanisch anregen Zellen in der Regel beschäftigen invasive körperliche Sonden (z. B. Zelle stossen) oder erfordert das Zusammenspiel von hochenergetischen Laserstrahlen mit Fremdkörpern (z. B. optische Pinzette). Magnetische Heizung kann Heizen spezifischen räumliche Positionen i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Mikhail Shapiro und Nikita Reznik für fruchtbare Diskussionen. Diese Arbeit wurde unterstützt von Startkapital von Western University of Health Sciences und NIH gewähren R21NS101384.
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
Referencias
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