Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode
Summary
Hier präsentieren wir eine empfindliche, schnelle und diskriminierende Post-Gel-Färbungsmethode, um RNAs mit RNA Mango Aptamern I, II, III oder IV abzubilden, wobei entweder native oder denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelverwendet werden. Nach dem Ausführen von Standard-PAGE-Gelen kann Mango-markierte RNA leicht mit TO1-Biotin gefärbt und dann mit allgemein verfügbaren Fluoreszenzlesern analysiert werden.
Abstract
Native und denaturierende Polyacrylamid-Gele werden routinemäßig verwendet, um die komplexe Mobilität von Ribonukleoprotein (RNP) zu charakterisieren bzw. die RNA-Größe zu messen. Da viele Gel-Imaging-Verfahren unspezifische Flecken oder teure Fluorophorsonden verwenden, sind empfindliche, diskriminierende und wirtschaftliche Gel-Imaging-Methoden sehr wünschenswert. RNA Mango-Kernsequenzen sind kleine (19–22 nt) Sequenzmotive, die, wenn sie durch einen beliebigen RNA-Stamm geschlossen werden, einfach und kostengünstig an eine RNA von Interesse angehängt werden können. Diese Mango-Tags binden mit hoher Affinität und Spezifität an einen Thiazol-orange Fluorophor-Ligand namens TO1-Biotin, der bei Bindung tausendfach fluoreszierender wird. Hier zeigen wir, dass Mango I, II, III und IV verwendet werden können, um RNA gezielt in Gelen mit hoher Empfindlichkeit abzubilden. Nur 62,5 Fmol RNA in nativen Gelen und 125 Fmol RNA in denaturierenden Gelen können durch Einweichen von Gelen in einem bildgebenden Puffer mit Kalium und 20 nM TO1-Biotin für 30 min nachgewiesen werden. Wir demonstrieren die Spezifität des Mango-markierten Systems, indem wir eine Mit mango-markierte 6S-Bakterien-RNA im Kontext einer komplexen Mischung aus gesamtbakterieller RNA abbilden.
Introduction
Mango ist ein RNA-Tagging-System, bestehend aus einem Satz von vier kleinen fluoreszierenden RNA-Aptamern, die fest (Nanomolarbindung) an einfache Derivate der Thiazol-Orange (TO1-Biotin, Abbildung 1A)1,2,3 binden . Bei der Bindung wird die Fluoreszenz dieses Liganden je nach spezifischem Aptamer um das 1.000- bis 4.000-fache erhöht. Die hohe Helligkeit des Mango-Systems, das für Mango III die des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (eGFP) in Kombination mit der nanomolaren Bindungsaffinität der RNA Mango-Aptamer übertrifft, ermöglicht es, sowohl bei der Bildgebung als auch bei der Reinigung von RNA eingesetzt zu werden. Komplexe2,4.
Die Röntgenstrukturen von Mango I5, II6und III7 wurden zu hoher Auflösung bestimmt, und alle drei Aptamer verwenden ein RNA-Quadruplex, um TO1-Biotin zu binden (Abbildung 1B–D). Die kompakten Kerne aller drei Aptamer werden über kompakte Adaptermotive aus der externen RNA-Sequenz isoliert. Mango I und II verwenden beide einen flexiblen GNRA-ähnlichen Schleifenadapter, um ihre Mango-Kerne mit einem beliebigen RNA-Duplex zu verbinden (Abbildung 1B, C). Im Gegensatz dazu verwendet Mango III ein starres Triplex-Motiv, um seinen Kern mit einer beliebigen RNA-Helix zu verbinden (Abbildung1D,violette Rückstände), während die Struktur von Mango IV derzeit nicht bekannt ist. Da der Ligandenbindungskern jedes dieser Aptamer durch diese Spiraladapter von der externen RNA-Sequenz getrennt ist, scheint es wahrscheinlich, dass sie alle einfach in eine Vielzahl von RNAs integriert werden können. Die bakterielle 6S-konforme RNA (Mango I), Komponenten des Hefespliceooms (Mango I) und der humanen 5S-RNA, U6-RNA und einerC/D-ScaRNA (Mango II und IV) wurden alle erfolgreich auf diese Weise 2,8getaggt, was darauf hindeutet, dass viele biologische RNAs können mit dem RNA Mango Aptamer System markiert werden.
Denaturing und native Gele werden häufig verwendet, um RNAs zu studieren. Denaturing Gels werden häufig verwendet, um die RNA-Größe oder DIE RNA-Verarbeitung zu beurteilen, aber typischerweise erfordern im Falle eines nördlichen Blots beispielsweise mehrere langsame und sequenzielle Schritte, um ein Bild zu erzeugen. Während andere fluorogene RNA-Aptamer wie RNA Spinat und Brokkoli erfolgreich für die Gelbildgebung9eingesetzt wurden, besitzt bisher kein fluorogenes Aptamersystem die hohe Helligkeit und Affinität des Mango-Systems, was es von erheblichem Interesse macht. um die Gel-Imaging-Fähigkeiten von Mango zu untersuchen. In dieser Studie fragten wir uns, ob das RNA-Mango-System einfach auf die Gel-Bildgebung ausgedehnt werden könnte, da die Anregungs- und Emissionswellenlängen von TO1-Biotin (510 nm bzw. 535 nm) für die Bildgebung im eGFP-Kanal geeignet sind, der den meisten fluoreszierenden Gel-Scanning-Instrumentierung.
Das hier vorgestellte Post-Gel-Färbeprotokoll bietet eine schnelle Möglichkeit, Mango-markierte RNA-Moleküle in nativen und denaturing Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Gelen (PAGE) gezielt zu detektieren. Bei dieser Färbemethode werden Gele in einem Kalium- und TO1-Biotinpuffer einweichen. RNA Mango Aptamer sind G-Quadruplex-basiert und Kalium wird benötigt, um solche Strukturen zu stabilisieren. Mithilfe von RNA, die aus minimalen Mango-kodierenden DNA-Vorlagen transkribiert wurde (siehe Protokollabschnitt), können wir einfach nur 62,5 Fmol RNA in nativen Gelen und 125 Fmol RNA in denaturierenden Gelen erkennen, indem wir ein einfaches Färbeprotokoll verwenden. Im Gegensatz zu häufigen unspezifischen Nukleinsäureflecken (siehe Tabelle der Materialien, die von nun an auf SG verwiesen werden) können wir Mango-markierte RNA auch dann eindeutig identifizieren, wenn hohe Konzentrationen der gesamten nicht markierten RNA in der Probe vorhanden sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein wesentlicher Vorteil des Mango-Fluoreszenz-Tags ist, dass ein einzelnes Tag auf verschiedene Arten verwendet werden kann. Die hohe Helligkeit und Affinität dieser Aptamer machen sie nicht nur für die Zellvisualisierung 2, sondern auch für die In-vitro-RNA- oder RNP-Reinigung4nützlich. Daher erweitert die Gel-Bildgebung die Vielseitigkeit des Mango-Tags auf einfache Weise. Die Empfindlichkeit der Mango-Gel-Bildgebung ist etwas geringer als die eines nördlichen Blots…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Razvan Cojocaru und Amir Abdolahzadeh für ihre technische Unterstützung und Lena Dolgosheina für das Korrekturlesen des Manuskripts. Die Finanzierung dieses Projekts wurde von einem Betriebskostenzuschuss des Canadian Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) an P.J.U. bereitgestellt.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
Referencias
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