포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화
Summary
여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.
Abstract
네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔은 리보뉴클레오프로테인(RNP) 복합 이동성을 특성화하고 RNA 크기를 측정하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 많은 젤 이미징 기술이 비특이적 얼룩 또는 고가의 형광공 프로브를 사용하므로 민감하고 차별적이며 경제적인 젤 이미징 방법론이 매우 바람직합니다. RNA 망고 코어 서열은 임의RNA 줄기에 의해 폐쇄될 때, 관심 있는 RNA에 간단하고 저렴하게 추가될 수 있는 작은(19-22 nt) 서열 모티프이다. 이 망고 꼬리표는 TO1-Biotin에게 불린 티아졸 오렌지 형광공 리간드에 높은 친화력 및 특이성과 결합합니다, 결합시 수천 배 더 형광이 됩니다. 여기서 우리는 망고 I, II, III 및 IV가 고감도를 가진 겔에서 RNA를 구체적으로 이미지화하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 네이티브 겔에서 RNA의 62.5 fmol과 변성 겔에서 RNA의 125 fmol만큼 적은 30 분 동안 칼륨 및 20 nM TO1-비오틴을 포함하는 이미징 버퍼에 겔을 담가 검출 할 수 있습니다. 우리는 총 세균 RNA의 복잡한 혼합물의 맥락에서 망고 태그가 달린 6S 세균 RNA를 이미징함으로써 망고 태그가 지정된 시스템의 특이성을 입증합니다.
Introduction
망고는 티아졸 오렌지(TO1-Biotin, 도 1A)의 단순 유도체에 단단히 결합하는 4개의 작은 형광 RNA aptamers 세트로 구성된 RNA태깅 시스템(TO1-Biotin, 도 1A)1,2,3 . 결합시, 이 리간드의 형광은 특정 압타머에 따라 1,000-4,000배 증가한다. 망고 III에 대한 망고 시스템의 높은 밝기는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 초과, RNA 망고 aptamers의 나노 몰 바인딩 친화도와 결합, 그것은 이미징 및 RNA의 정제 모두에 사용할 수 있습니다 단지2,4.
망고 I 5, II6및 III7의 X선 구조는 고분해능으로 결정되었으며, 세 압타머 는 모두 RNA 사중 플렉스를 사용하여 TO1-Biotin을 결합합니다 (도1B-D). 세 압타머의 컴팩트 코어는 컴팩트 어댑터 모티프를 통해 외부 RNA 서열로부터 분리됩니다. 망고 I 및 II 둘 다 임의의 RNA 양면에 그들의 망고 코어를 연결하는 유연한 GNRA 같이 루프 어댑터를 이용합니다 (그림1B,C). 대조적으로, 망고 III는 망고 IV의 구조가 현재 알려져 있지 않은 동안, 임의의 RNA 나선 (그림1D,보라색 잔류물)에 코어를 연결하는 단단한 트리플렉스 모티프를 사용합니다. 이들 각 aptamers의 리간드 결합 코어는 이러한 헬리컬 어댑터에 의해 외부 RNA 서열로부터 분리됨에 따라, 그들은 모두 단순히 다양한 RNA에 통합될 수 있는 것으로 보인다. 세균6S 조절 RNA(망고 I), 효모 스플리세오좀(망고 I) 및 인간 5S RNA, U6 RNA 및 C/D scaRNA(망고 II 및 IV)의 성분이 모두 이 방식으로 성공적으로 태그가 지정되어 2,8,많은 것을 시사합니다. 생물학적 RNA는 RNA 망고 압타머 시스템을 사용하여 태그가 지정될 수 있다.
변성 및 네이티브 젤은 일반적으로 RNA를 연구하는 데 사용됩니다. 치수화 겔은 종종 RNA 크기 또는 RNA 처리를 판단하는 데 사용되지만, 전형적으로, 북부 블롯의 경우, 예를 들어, 이미지를 생성하기 위해 몇 가지 느리고 순차적인 단계가 필요하다. RNA 시금치 및 브로콜리와 같은 다른 RNA 형광 압타머는 젤 이미징9에 성공적으로 사용되었지만 현재까지 는 망고 시스템의 높은 밝기와 친화성을 가지고 있지 않으며 상당한 관심을 가지고 있습니다. 망고의 젤 이미징 능력을 조사하기 위해. 이 연구에서는, 우리는 RNA 망고 시스템이 TO1-Biotin의 여기 그리고 방출 파장 (각각 510 nm 및 535 nm)이 대부분의 형광에 일반적인 eGFP 채널에 있는 화상 진찰을 위해 적당하기 때문에, 단순히 젤 화상 진찰에 확장될 수 있었다는 것을 궁금했습니다 겔 스캐닝 계측.
여기에 제시된 포스트 겔 염색 프로토콜은 망고 태그가 달린 RNA 분자를 네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔에서 특이하게 검출하는 신속한 방법을 제공한다. 이 염색 방법은 칼륨과 TO1-비오틴을 포함하는 완충제에 젤을 담그는 것을 포함합니다. RNA 망고 압태머는 G-사중플렉스 기반이며 칼륨은 이러한 구조를 안정화하는 데 필요하다. 최소한의 망고 인코딩 DNA 템플릿에서 전사 된 RNA를 사용하여 (프로토콜 섹션 참조), 우리는 간단하고 염색 프로토콜을 사용하여 네이티브 젤에서 RNA의 62.5 fmol과 RNA의 125 fmol을 간단하게 염색하여 간단하게 검출 할 수 있습니다. 일반적인 비특이적 핵산 얼룩과는 대조적으로(본명으로부터 SG라고 하는 물질 표참조), 우리는 총 태그가 없는 RNA의 고농도가 샘플에 존재하는 경우에도 망고 태그가 지정된 RNA를 명확하게 식별할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
망고 형광 태그의 중요한 장점은 단일 태그를 여러 가지 방법으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이러한 aptamers의 높은 밝기와 친화력은 세포 시각화2뿐만 아니라 시험관 내 RNA 또는 RNP 정제4에도유용하게 만듭니다. 따라서 젤 이미징은 망고 태그의 다기능성을 간편하게 확장합니다. 망고 겔 화상 진찰 감도는 북부 얼룩14의 그것 보다는 약간 더 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 라즈반 코조카루와 아미르 압돌라자데의 기술적 지원과 원고를 증명해 준 레나 돌고시나에게 감사를 표한다. 이 프로젝트에 대한 기금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)가 P.J.U.에 보조금을 운영함으로써 제공되었습니다.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
Referencias
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- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Bioquímica. 57, 3544-3548 (2018).
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