ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグRNAの蛍光可視化
Summary
ここでは、RNAマンゴーアプタマーI、II、III、またはIVでタグ付けされたRNAを画像化する敏感で迅速かつ判別的なポストゲル染色法を、天然または未消化ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルを用いて提示する。標準的なPAGEゲルを実行した後、マンゴータグ付きRNAはTO1-Biotinで容易に染色し、一般的に利用可能な蛍光リーダーを使用して分析することができます。
Abstract
天然および変性ポリアクリルアミドゲルは、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体移動性を特徴付け、それぞれRNAサイズを測定するために日常的に使用されます。多くのゲルイメージング技術は、非特異的な染色や高価な蛍光色素プローブを使用するため、敏感、判別、および経済的なゲルイメージング方法論が非常に望ましい。RNAマンゴーコア配列は、任意のRNAステムによって閉じた場合、単にかつ安価に目的とするRNAに付加することができる小さな(19-22 nt)配列モチーフである。これらのマンゴータグは、TO1-Biotinと呼ばれるチアゾールオレンジ蛍光リガンドに高い親和性と特異性を結合し、結合時に数千倍の蛍光になります。ここで、マンゴーI、II、III、およびIVは、高感度のゲル中のRNAを特異的に画像化するために使用できることを示す。天然ゲル中のRNAの62.5 fmolと、入型ゲル中のRNAの125 fmolは、カリウムを含む画像バッファーにゲルを浸漬し、20nM TO1-Biotinを30分間検出することができる。マンゴータグ付き6S細菌RNAを、全細菌RNAの複雑な混合物のコンテキストでイメージングすることにより、マンゴータグ付きシステムの特異性を実証する。
Introduction
マンゴーは、チアゾールオレンジ(TO1-Biotin、図1A)1、2、3の単純な誘導体に密結合する4つの小さな蛍光RNAアプタマーのセットからなるRNAタグ付けシステムです。.結合すると、このリガンドの蛍光は、特定のアプタマーに応じて1,000〜4,000倍に増加する。マンゴーIIIの高輝度は、強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を超えるマンゴー系の高輝度と、RNAマンゴーアプタマーのナノモル結合親和性と組み合わせることで、RNAのイメージングと精製の両方に使用することができます。複合体2,4.
マンゴーI5、II6、およびIII7のX線構造は高分解能に決定されており、3つのアプタマーはすべてRNA四分円を利用してTO1-Biotin(図1B-D)を結合する。すべての3つのアプタマーの密集した中心は密集したアダプターのモチーフによって外的なRNA配列から隔離される。マンゴーIとIIは、柔軟なGNRAのようなループアダプタを使用して、マンゴーコアを任意のRNAデュプレックスに接続します(図1B,C)。対照的に、マンゴーIIIは、そのコアを任意のRNAらせん(図1D、紫色の残渣)に接続するために剛性トリプレックスモチーフを使用していますが、マンゴーIVの構造は現在知られていません。これらのアプタマーのリガンド結合コアは、これらのヘリカルアダプターによって外部RNA配列から分離されるので、それらはすべて単に様々なRNAに組み込むことができる可能性が高い。細菌6S調節RNA(マンゴーI)、酵母スプリセオソーム(マンゴーI)の成分、およびヒト5S RNA、U6 RNA、およびC/D scaRNA(マンゴーIIおよびIV)はすべて、この方法でうまくタグ付けされている2、8、多くであることを示唆している生物学的RNAは、RNAマンゴーアプタマー系を使用してタグ付けすることができます。
RNAの研究には、未生および天然ゲルが一般的に使用されます。転移ゲルは、RNAサイズまたはRNA処理を判断するためによく使用されますが、典型的には、北部のブロットの場合、例えば、画像を生成するためにいくつかの遅い、逐次的なステップを必要とします。RNAホウレンソウやブロッコリーなどの他のRNAフルオロゲンアプタマーはゲルイメージング9に成功していますが、これまでフルオロゲンアプタマー系はマンゴー系の高輝度と親和性を持たないため、かなりの関心を持っています。マンゴーのゲルイメージング能力を調べるために。本研究では、TO1-Biotin(それぞれ510nmおよび535nm)の励起波長がほとんどの蛍光に共通するeGFPチャネルでのイメージングに適しているので、RNAマンゴーシステムを単にゲルイメージングに拡張できるかどうか疑問に思いました。ゲルスキャンの器械使用。
ここで提示されるポストゲル染色プロトコルは、マンゴータグ付きRNA分子をネイティブおよび脱帰性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルで特異的に検出する迅速な方法を提供します。この染色方法は、カリウムおよびTO1-Biotinを含む緩衝液にゲルを浸すことを含む。RNAマンゴーアプタマーはG-四重化基基であり、カリウムはそのような構造を安定化するために必要とされる。最小限のマンゴーコードDNAテンプレートから転写されたRNA(プロトコルセクションを参照)を使用して、単純な染色プロトコルを使用して、ネイティブゲル中のRNAの62.5 fmolと脱変性ゲル中のRNAの125 fmolをわずかしか検出できません。一般的な非特異的核酸染色とは対照的に(材料の表を参照)、サンプル中にタグ付けされていない全高濃度のRNAが存在する場合でも、マンゴータグ付きRNAを明確に同定することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
マンゴー蛍光タグの大きな利点は、1つのタグが複数の方法で使用できることです。これらのアプタマーの高輝度と親和性は、細胞可視化2だけでなく、インビトロRNAまたはRNP精製4にも有用です。従って、ゲルイメージ投射はマンゴーのタグの多様性を簡単な方法で拡張する。マンゴーゲルイメージング感度は、ノーザンブロット14のそれ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ラズヴァン・コジョカルとアミール・アブドラザデの技術支援とレナ・ドルゴシーナに原稿を校正してくれたことに感謝している。このプロジェクトの資金は、カナダ自然科学工学研究協議会(NSERC)がP.J.Uに対する運営助成金によって提供されました。
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
Referencias
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Bioquímica. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
