قياس الإيقاعات اليومية في التدفق التلقائي والبروتياسومال
Summary
نحن نصف بروتوكولنا لقياس الإيقاعات البيولوجية في تقويض البروتين عن طريق autophagy وبروتياسوم في كبد الماوس.
Abstract
تستخدم الخلايا عدة طرق لإعادة تدوير البروتينات غير المرغوب فيها وغيرها من المواد، بما في ذلك مسارات الليسوسومال وغير الليسوسومال. ويسمى المسار الرئيسي تعتمد على الليسوسوم autophagy، في حين أن الطريقة الأولية غير الليسوسومل لتقويض البروتين هو نظام فيوكويتين بروتياسوم. وتشير الدراسات الحديثة في الكائنات الحية النموذجية إلى أن نشاط كل من الأوتوفاجي ونظام يوبيكويتين بروتياسوم ليس ثابتاً طوال اليوم ولكنه يختلف بدلاً من ذلك وفقاً لإيقاع يومي (سيركاديان). القدرة على قياس الإيقاعات البيولوجية في دوران البروتين مهم لفهم كيفية تحقيق مراقبة الجودة الخلوية ولفهم ديناميات بروتينات محددة ذات أهمية. هنا نقدم بروتوكول موحد لتحديد كمية التدفق الذاتي والبروتياسومال في الجسم الحي الذي يلتقط المكون circadian من دوران البروتين. يتضمن بروتوكولنا تفاصيل لمناولة الماوس، ومعالجة الأنسجة، والكسر، والقياس الكمي للتدفق التلقائي باستخدام كبد الماوس كمادة البداية.
Introduction
تشير إيقاعات Circadian إلى الاختلافات اليومية التي يمكن التنبؤ بها في الوظيفة البيولوجية التي تظهر في جميع أنحاء الطبيعة. وهي موجودة في كل مقياس بيولوجي، من السلوكيات العيانية مثل دورات النوم والاستيقاظ، إلى الظواهر الجزيئية مثل الوفرة الإيقاعية للجزيئات الحيوية. في السنوات الأخيرة، تم تحويل البحوث في إيقاعات circadian من خلال اكتشاف “الجينات على مدار الساعة” التي هي حاسمة لتوليد إيقاع circadian. وقد كشفت الدراسات في الفئران الجينات على مدار الساعة خروج المغلوب دورا مركزيا لإيقاعات circadian في تنظيم العمليات الخلوية الأساسية زمنيا مثل التمثيل الغذائي1. من بين الطرق إيقاعات circadian جعل هذا يحدث عن طريق نقل بنية زمنية لتقويض البروتين.
وقد أظهرت عدة مجموعات بما في ذلك بلدنا أن اثنين من السبل الرئيسية لتقويض البروتين الخلوي، autophagy ونظام ubiquitin-بروتياسوم، تخضع لإيقاعات اليومية2،3،4،5. يمثل Autophagy الذراع تعتمد على اللعيب من تقويض البروتين الذي يتم تسليم البروتينات ذات الأهمية إلى هذا organelle المهينة إما من خلال بناء حويصلة جديدة (macroautophagy) أو من خلال نقل مباشرة على الرغم من قناة (chaperone بوساطة autophagy)6. نظام ubiquitin-proteasome هو المسار الرئيسي غير الليسوسوم، حيث البروتينات هي بولي في كل مكان ومن ثم تغذية في بروتياسوم، وهو آلة مهينة الجزيئية الكلية وجدت في جميع أنحاء السيتوبلازم والنواة7،8. الإيقاعات في النشاط الذاتي وproteasomal مهمة لأنها من المرجح أن تلعب دورا في التدبير المنزلي الخلوية. ونتيجة لذلك، فمن المفيد أن يكون لديك إجراء موحد يمكن الكشف عن التذبذبات اليومية في تقويض البروتين الذي يتوافق مع نماذج الأمراض ما قبل السريرية.
هنا، ونحن نقدم بروتوكولنا لتحديد كمية الاختلافات اليومية في تدفق autophagic في كبد الماوس، والتي كانت بمثابة أساس للعمل في مختبرنا3،9. وتصنف طريقتنا على أنها “قياس دوران”10، وهو نهج تستخدمه العديد من المجموعات لقياس النشاط البروتيوليتيك (أو تدفق). في هذا النهج، يتم إعطاء مثبطات البروتياز الخاصة بالليسوسوم أو بروتياسومس للفئران ومن ثم يتم الحصول على عينات الأنسجة بعد فترة زمنية محددة. وفي موازاة ذلك، يتم الحصول على عينات من الأنسجة من الفئران التي تتعرض لحقن الشام. عينات الأنسجة متجانسة ومن ثم فصل كيميائيا بيولوجيا للحصول على الكسور الليسوم المخصب والسيتوبلازمية. ثم يتم تحليل هذه الكسور بالتوازي عبر النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بعلامات الماكرووتفاجي (LC3b و p62) أو ركائز بروتياسومال (بروتين متعدد الكل شيء). مع مرور الوقت، الحيوانات التي يتم حقنها بمثبطات البروتياز تتراكم البروتينات التي عادة ما يتم إعادة تدويرها. ونتيجة لذلك، يتم الاستدلال على معدل دوران عن طريق مقارنة وفرة البروتينات علامة في العينات المعالجة مثبطات البروتياز إلى العينات المعالجة بالشام. من خلال تكرار هذه الطريقة في فترات زمنية محددة عبر اليوم فمن الممكن لإعادة بناء الاختلافات circadian في proteolysis(الشكل 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف بروتوكولنا وسيلة مباشرة من الناحية الفنية لقياس الإيقاعات البيولوجية في دوران البروتين في الفئران باستخدام معدات البيولوجيا الجزيئية المتاحة عادة. بسبب طول تجارب السلاسل الزمنية وعدد العينات البيولوجية المعنية، من المهم أن تكون متسقة عبر التجربة بأكملها فيما يتعلق بكيفية حقن الفئ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل RO1HL135846 ومنحة معهد تنمية الطفل (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
Referencias
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
