Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal
Summary
Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.
Abstract
Las células emplean varios métodos para reciclar proteínas no deseadas y otros materiales, incluyendo vías lisosomal y no lisosomal. La vía principal dependiente del lisosoma se llama autofagia, mientras que el método principal no lisosomal para el catabolismo proteico es el sistema ubiquitina-proteosoma. Estudios recientes en organismos modelo sugieren que la actividad de la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma no es constante a lo largo del día, sino que varía según un ritmo diario (circadiano). La capacidad de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas es importante para entender cómo se logra el control de calidad celular y para entender la dinámica de proteínas específicas de interés. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para cuantificar el flujo autofágico y proteasomal in vivo que captura el componente circadiano de la rotación de proteínas. Nuestro protocolo incluye detalles para el manejo del ratón, procesamiento de tejidos, fraccionamiento y cuantificación de flujo autofágico utilizando el hígado del ratón como material de partida.
Introduction
Los ritmos circadianos se refieren a variaciones diarias y predecibles en la función biológica que son evidentes en toda la naturaleza. Existen a todas las escalas biológicas, desde comportamientos macroscópicos como ciclos sueño-vigilia, hasta fenómenos moleculares como la abundancia rítmica de biomoléculas. En los últimos años, la investigación sobre los ritmos circadianos se ha transformado por el descubrimiento de “genes de reloj” que son críticos para la generación del ritmo circadiano. Los estudios en ratones knockout del gen del reloj han revelado un papel central para los ritmos circadianos en la organización temporal de los procesos celulares centrales como el metabolismo1. Entre las formas en que los ritmos circadianos hacen que esto suceda es impartir una estructura temporal al catabolismo proteico.
Varios grupos incluyendo el nuestro han demostrado que las dos principales vías para el catabolismo proteico celular, la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma, están sujetas a ritmos diurnos2,3,4,5. La autofagia representa el brazo lisososodependiente del catabolismo proteico en el que las proteínas de interés se entregan a este orgánulo degradante ya sea a través de la construcción de una vesícula novedosa (macroautofagia) o a través de una translocación directa a través de una canal (autofagia mediada por chaperón)6. El sistema ubiquitina-proteasoma es la principal vía no lisosomal, donde las proteínas son poliubiquitinadas y luego se alimentan en el proteosoma, una máquina degradante macromolecular que se encuentra en todo el citoplasma y el núcleo7,8. Los ritmos en la actividad autofágica y proteasomal son importantes porque probablemente juegan un papel en la limpieza celular. Como resultado, es valioso tener un procedimiento estandarizado que pueda detectar oscilaciones diarias en el catabolismo proteico que es compatible con modelos de enfermedad preclínica.
Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para cuantificar las variaciones diurnas en el flujo autofágico en el hígado de ratón, que ha servido de base para el trabajo en nuestro laboratorio3,9. Nuestro método se clasifica como un “ensayo de volumen de negocios”10,un enfoque utilizado por numerosos grupos para medir la actividad proteolítica (o flujo). En este enfoque, los inhibidores de la proteasa específicos de los lisosomas o proteasomas se administran a ratones y luego se obtienen muestras de tejido después de un intervalo de tiempo fijo. Paralelamente, las muestras de tejido se obtienen de ratones sometidos a inyecciones falsas. Las muestras de tejido se homogeneizan y luego se separan bioquímicamente para obtener las fracciones lisosomas y citoplasmáticas. Estas fracciones se analizan en paralelo a través de la hincha occidental utilizando anticuerpos específicos de los marcadores de macroautofagia (LC3b y p62) o sustratos proteasomales (proteína poliubiquitinada). Con el tiempo, los animales inyectados con inhibidores de la proteasa acumulan proteínas que normalmente se habrían reciclado. Como resultado, la tasa de rotación se deduce comparando la abundancia de proteínas marcadoras en las muestras tratadas con inhibidores de la proteasa con las muestras tratadas con farsa. Al repetir este método a intervalos de tiempo fijos a lo largo del día es posible reconstruir variaciones circadianas en la proteólisis(Figura 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro protocolo describe un medio técnicamente sencillo de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas en ratones utilizando equipos de biología molecular comúnmente disponibles. Debido a la duración de los experimentos de series temporales y el número de muestras biológicas involucradas, es importante ser consistente en todo el experimento con respecto a cómo se inyectan los ratones, el momento de la adquisición de tejidos y el procesamiento bioquímico de Muestras. Las etapas de inyección, eut…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por RO1HL135846 y una beca del Instituto de Desarrollo Infantil (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
Referencias
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