Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

Summary

Nós descrevemos nosso protocolo para medir ritmos biológicos no catabolismo da proteína através do autofagia e do Proteassoma no fígado do rato.

Abstract

As células empregam vários métodos para reciclagem de proteínas indesejadas e outros materiais, incluindo vias lisossomais e não-lisossossômicas. A via lisossoma-dependente principal é chamada de autofagia, enquanto o método primário não-lisossomal para o catabolismo protéico é o sistema de oniquitina-proteasome. Estudos recentes em organismos modelo sugerem que a atividade da autofagia e do sistema de ubiquitina-proteasome não é constante ao longo do dia, mas em vez disso, varia de acordo com um ritmo diário (circadiano). A capacidade de medir ritmos biológicos no turnover da proteína é importante para compreender como o controle de qualidade celular é alcançado e para compreender a dinâmica de proteínas específicas de interesse. Aqui nós apresentamos um protocolo estandardizado para quantificar in vivo o fluxo autofágico e degradação que captura o componente circadiano do retorno da proteína. Nosso protocolo inclui detalhes para manipulação do mouse, processamento de tecidos, fraccionamento e quantificação de fluxo autofágico usando o fígado do mouse como o material de partida.

Introduction

Os ritmos circadianos referem-se a variações diárias e previsíveis na função biológica que são aparentes em toda a natureza. Existem em cada escala biológica, a partir de comportamentos macroscópicos como ciclos de vigília-sono, a fenômenos moleculares como a abundância rítmica de biomoléculas. Nos últimos anos, a pesquisa sobre ritmos circadianos tem sido transformada pela descoberta de “genes do relógio” que são críticos para a geração do ritmo circadiano. Os estudos em camundongos knockout do gene do pulso de disparo revelaram um papel central para ritmos circadiano em organizar temporally processos celulares do núcleo tais como o metabolismo¹. Entre as maneiras ritmos circadianos fazer isso acontecer é por transmitir uma estrutura temporal para o catabolismo de proteínas.

Vários grupos, incluindo o nosso, mostraram que as duas principais avenidas para o catabolismo de proteínas celulares, a autofagia e o sistema ubiquitina-proteasome, estão sujeitas a ritmos diurnos^2,3,4,5. Autophagy representa o braço lysosome-dependente do catabolismo da proteína em que as proteínas do interesse são entregadas a este organela degradative através da construção de um vesícula novo (macroautophagy) ou através do translocação direto embora um canal (Autophagy negociado Chaperone)⁶. O sistema de ubiquitina-proteasome é a principal via não-lisossomal, onde as proteínas são poli-ubiquitadas e, em seguida, alimentadas no proteasome, uma máquina degradativa macromolecular encontrada em todo o citoplasma e núcleo^7,8. Os ritmos na atividade do autofágico e do degradação são importantes porque jogam provavelmente um papel no Housekeeping celular. Em conseqüência, é valioso ter um procedimento padronizado que possa detectar oscilações diárias no catabolismo da proteína que é compatível com modelos pré-clínicos da doença.

Aqui, nós fornecemos nosso protocolo para quantificar variações diurnas no fluxo autofágico no fígado do rato, que serviu como a base para o trabalho em nosso laboratório^3,9. Nosso método é classificado como um “ensaio de turnover”¹⁰, uma abordagem utilizada por inúmeros grupos para medir a atividade proteolítica (ou fluxo). Nesta abordagem, os inibidores de protease específicos para lisossomos ou proteasomas são administrados em camundongos e, em seguida, amostras de tecido são obtidas após um intervalo de tempo fixo. Em paralelo, amostras de tecido são obtidas de camundongos submetidos a injeções simuladas. As amostras de tecido são homogeneizadas e, em seguida, separadas bioquimicamente para obter as frações lisossome-enriquecidas e citoplasmáticas. Essas frações são então analisadas em paralelo via Western blotting usando anticorpos específicos para marcadores de macroautofagia (LC3b e p62) ou substratos degradação (proteína poli-ubiquitinada). Ao longo do tempo, os animais injetados com inibidores da protease acumulam proteínas que normalmente teriam sido recicladas. Como resultado, a taxa de rotatividade é inferida comparando-se a abundância de proteínas de marcador nas amostras tratadas com inibidor de protease às amostras tratadas com Sham. Ao repetir este método em intervalos de tempo fixos ao longo do dia é possível reconstruir as variações circadianas na proteólise (Figura 1a).

Protocol

O protocolo aqui descrito foi aprovado pela Universidade de Washington em St. Louis animal Care e use Committee (IACUC). 1. mouse habitação e design experimental Para detectar ritmos diários no retorno da proteína, os ratos da casa (macho ou fêmea C57BL/6J, 4 − 8 semanas velho, 20 − 25 g) a luz padrão de 12 h/ciclos escuros com alimento forneceram ad libitum. Para evitar enfatizar os animais, aclimatar camundongos por pelo menos uma semana na instalação antes de …

Representative Results

Os dados representativos são apresentados na Figura 2a, B, e a quantificação desses dados é fornecida na Figura 2C, D (vide também arquivo suplementar “dados de amostra”). Para simplificar, não representamos controles de carregamento na Figura 2 , mas estes devem ser obtidos em paralelo. Tipicamente, os borrões ocidentais de encontro ao β-Actin são usados para esta finalida…

Discussion

Nosso protocolo descreve um meio tecnicamente direto de medir ritmos biológicos na rotatividade de proteínas em camundongos usando equipamentos de biologia molecular comumente disponíveis. Por causa da duração dos experimentos em séries temporais e do número de amostras biológicas envolvidas, é importante ser consistente em todo o experimento sobre como os camundongos são injetados, o tempo de aquisição de tecidos e o processamento bioquímico de Amostras. As etapas de injeção, eutanásia e luxação cervic…

Materials

4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830