Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal
Summary
Nous décrivons notre protocole pour mesurer des rythmes biologiques dans le catabolisme de protéine par l’autophagie et le protéasome dans le foie de souris.
Abstract
Les cellules utilisent plusieurs méthodes pour recycler les protéines indésirables et d’autres matériaux, y compris les voies lysosomal et non-lysosomal. La voie lysosome-dépendante principale est appelée autophagie, alors que la méthode non-lysosomale primaire pour le catabolisme de protéine est le système ubiquitine-protéasome. Des études récentes sur des organismes modèles suggèrent que l’activité de l’autophagie et du système ubiquitine-protéasome n’est pas constante tout au long de la journée, mais varie plutôt selon un rythme quotidien (circadien). La capacité de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines est importante pour comprendre comment le contrôle de la qualité cellulaire est atteint et pour comprendre la dynamique de protéines spécifiques d’intérêt. Ici nous présentons un protocole normalisé pour quantifier le flux autophagique et protéasomal in vivo qui capture la composante circadienne du chiffre d’affaires de protéine. Notre protocole inclut des détails pour la manipulation de souris, le traitement de tissu, la fractionnement, et la quantification automatique de flux utilisant le foie de souris comme matériel de commencement.
Introduction
Les rythmes circadiens se réfèrent à des variations quotidiennes et prévisibles de la fonction biologique qui sont apparentes dans toute la nature. Ils existent à toutes les échelles biologiques, des comportements macroscopiques comme les cycles veille-sommeil, aux phénomènes moléculaires comme l’abondance rythmique des biomolécules. Ces dernières années, la recherche sur les rythmes circadiens a été transformée par la découverte de « gènes de l’horloge » qui sont essentiels pour la génération de rythmes circadiens. Les études dans les souris knock-out de gène d’horloge ont indiqué un rôle central pour des rythmes circadiens en organisant temporellement des processus cellulaires de noyau tels que le métabolisme1. Parmi les façons dont les rythmes circadiens y arriver est de transmettre une structure temporelle au catabolisme protéique.
Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont montré que les deux principales avenues pour le catabolisme des protéines cellulaires, l’autophagie et le système ubiquitine-protéasome, sont soumises à des rythmes diurnes2,3,4,5. L’autophagie représente le bras lysosome-dépendant du catabolisme protéique dans lequel les protéines d’intérêt sont livrées à cet organelle dégradante soit par la construction d’une vésicule nouvelle (macroautophagie) ou par translocation directe par un canal (autophagie médiée par chaperon)6. Le système ubiquitine-protéasome est la principale voie non-lysosomale, où les protéines sont poly-ubiquitinated et ensuite alimentés dans le protéasome, une machine de dégradation macromoléculaire trouvée dans tout le cytoplasme et le noyau7,8. Les rythmes dans l’activité autophagique et protéasomale sont importants parce qu’ils jouent probablement un rôle dans l’entretien ménager cellulaire. En conséquence, il est utile d’avoir une procédure standardisée qui peut détecter les oscillations quotidiennes dans le catabolisme protéique qui est compatible avec les modèles précliniques de maladie.
Ici, nous fournissons notre protocole pour quantifier les variations diurnes dans le flux autophégique dans le foie de souris, qui a servi de base pour le travail dans notre laboratoire3,9. Notre méthode est classée comme un « ruse »10, une approche utilisée par de nombreux groupes pour mesurer l’activité protéolytique (ou flux). Dans cette approche, des inhibiteurs de la protéase spécifiques aux lysosomes ou aux protéasomes sont administrés à des souris, puis des échantillons de tissus sont obtenus après un intervalle de temps fixe. En parallèle, des échantillons de tissus sont obtenus à partir de souris soumises à des injections fictives. Les échantillons de tissus sont homogénéisés, puis biochimiques séparés pour obtenir les fractions lysosome-enrichies et cytoplasmiques. Ces fractions sont ensuite analysées en parallèle par le biais de ballonnements occidentaux à l’aide d’anticorps spécifiques aux marqueurs macroautophanes (LC3b et p62) ou de substrats protéasomals (protéines poly-ubiquitinated). Au fil du temps, les animaux injectés avec des inhibiteurs de la protéase accumulent des protéines qui auraient normalement été recyclées. En conséquence, le taux de rotation est déduit en comparant l’abondance des protéines marqueurs dans les échantillons traités par protéase-inhibiteur aux échantillons traités par faux. En répétant cette méthode à intervalles fixes tout au long de la journée, il est possible de reconstituer les variations circadiennes de la protéolyse (Figure 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre protocole décrit un moyen techniquement simple de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines chez les souris à l’aide d’équipements de biologie moléculaire couramment disponibles. En raison de la durée des expériences de la série chronologique et du nombre d’échantillons biologiques impliqués, il est important d’être cohérent dans l’ensemble de l’expérience en ce qui concerne la façon dont les souris sont injectées, le moment de l’acquisition des tissus et le traitement bioc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par RO1HL135846 et une subvention de l’Institut de développement de l’enfance (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
Referencias
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