العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية
Summary
الثقافات العضوية المستمدة من المريض من سرطانات الغدة السرطانية الاقنيه البنكرياس هي نموذج بسرعة 3-الابعاد التي تمثل المقصورات الخلايا الظهاريه الورم مع الإخلاص عاليه, تمكين البحوث متعديه في هذا الخبيثة القاتلة. هنا ، ونحن نقدم أساليب مفصله لإنشاء ونشر العضوية وكذلك لاجراء الاختبارات البيولوجية ذات الصلة باستخدام هذه النماذج.
Abstract
سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو من بين الأورام الخبيثة الأكثر فتكا. في الاونه الاخيره ، تم وصف الجيل التالي من أساليب الثقافة العضوية التي تمكن من النمذجة ثلاثية الابعاد (3D) لهذا المرض. ويمكن عزل نماذج العضو العضوي المشتقة من المريض من كل من العينات الجراحية وكذلك الخزعات الصغيرة والشكل السريع في الثقافة. والاهم من ذلك ، تحافظ النماذج العضوية علي التعديلات الوراثية المسببة للامراض المكتشفة في ورم المريض وهي تنبئي باستجابة المريض للعلاج ، التالي تمكين الدراسات الانتقالية. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولات شامله للتكيف الانسجه ثقافة سير العمل لدراسة 3D ، مصفوفة مضمنه ، نماذج organoid. نحن التفاصيل الطرق والاعتبارات لعزل ونشر الاساسيه PDAC العضوي. وعلاوة علي ذلك ، فاننا نوضح كيف يتم اعداد وسائل الاعلام العضوية مفصل والجودة التي تسيطر عليها في المختبر. وأخيرا ، فاننا وصف الاختبارات لتوصيف المصب من النماذج العضوية مثل عزل الأحماض النووية (DNA و RNA) ، واختبار المخدرات. ومن المهم ان نقدم الاعتبارات الحاسمة لتنفيذ منهجيه organoid في مختبر البحوث.
Introduction
سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو مرض مميت يتميز بالتشخيص المتاخر في معظم المرضي ، ونقص العلاجات الفعالة ، وما ينجم عنه من انخفاض معدل البقاء الكلي لمده 5 سنوات والذي لا يزال اقل من 10%1. يتم تشخيص 20 ٪ فقط من المرضي مع مرض موضعي مناسبه للتدخل الجراحي العلاجي2،3. وعاده ما يتم التعامل مع المرضي المتبقيين مع مزيج من عوامل العلاج الكيميائي التي تكون فعاله في اقليه من المرضي4,5. لتلبيه هذه الاحتياجات السريرية الملحة ، يعمل الباحثون بنشاط علي استراتيجيات الكشف المبكر وتطوير علاجات أكثر فعاليه. لتسريع الترجمة السريرية من الاكتشافات الهامه ، والعلماء يستخدمون نماذج الماوس المهندسة وراثيا ، المريض المستمدة xenografts ، خطوط الخلايا أحاديه الطبقة ، و ، في الاونه الاخيره ، نماذج organoid6.
الثقافة العضوية الظهاريه ثلاثية الابعاد باستخدام عامل النمو و Wnt-ligand الظروف الغنية لتحفيز انتشار الخلايا السلف غير المتحولة ووصفت لأول مره للأمعاء الفئران7 وتم تكييفها بسرعة لأنسجه البنكرياس البشرية العادية8. بالاضافه إلى الانسجه الانبوبيه العادية ، ومنهجيه organoid يسمح للعزل ، والتوسع ، ودراسة PDAC الإنسان8. الأهم من ذلك ، فان الطريقة تدعم إنشاء organoids من العينات الجراحية ، فضلا عن الخزعات الدقيقة والاساسيه ابره ، مما يسمح للباحثين لدراسة جميع مراحل المرض9،10. ومن المثير للاهتمام ان العضوية المشتقة من المريض تلخص الأنواع الفرعية الموصوفة جيدا للورم وقد تمكن من تطوير منصات الطب الدقيقة9,11.
البروتوكولات العضوية الحالية ل PDAC تمكين التوسع الناجح لأكثر من 70 ٪ من عينات المريض من العلاج الكيميائي الساذج المرضي9. هنا نقدم الأساليب القياسية المستخدمة من قبل المختبر لدينا لعزل ، وتوسيع ، وتوصيف المستمدة من المريض العضوي PDAC. وقد وصفت منهجيات organoid أخرى pdac12،13 ولكن لم يتم اجراء مقارنه لهذه الطريقة بدقه. وبما ان هذه التكنولوجيا جديده نسبيا وتتقدم بسرعة ، فاننا نتوقع ان تستمر هذه البروتوكولات في التطور والتحسن ؛ ومع ذلك فان مبادئ التعامل مع الانسجه والثقافة العضوية ستظل مفيده.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم البروتوكولات الحالية لعزل وتوسيع وتوصيف العضوي PDAC المشتقة من المريض. لدينا معدل النجاح الحالي لإنشاء ثقافة organoid هو أكثر من 70 ٪. التالي ، فان هذه الأساليب لم تكتمل بعد ومن المتوقع ان تتحسن وتتطور مع مرور الوقت. وينبغي إيلاء الاعتبار الهام لحجم العينة ، حيث ان PDAC لديه شريط سينمائي ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لدعم جامعه كاليفورنيا في سان دييغو Moores مركز السرطان الحيوي والانسجه الموارد المشتركة التكنولوجيا ، وأعضاء مختبر Lowy ، وجامعه كاليفورنيا في سان دييغو قسم الجراحة ، قسم الأورام الجراحية. ويدعم AML بسخاء من قبل المعاهد القومية للصحة CA155620, SU2C CRUK Lustgarten مؤسسه السرطان البنكرياس جائزه فريق الحلم (SU2C-20-16), والجهات المانحة للصندوق لعلاج سرطان البنكرياس.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
